曹天輝 費(fèi)東生 潘尚哈 廉志遠(yuǎn) 桂明國 趙鳴雁

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院ICU，黑龍江 哈爾濱 150001)

膿毒癥以及其誘發(fā)的膿毒性休克已成為當(dāng)今重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者住院死亡率的重要原因〔1〕。老齡患者因機(jī)體抵抗力低下，器官功能減退，膿毒癥發(fā)生后的預(yù)后更差。在膿毒癥發(fā)生與形成過程中，肝臟是最容易受損的器官之一。血紅素氧合酶(HO)-1又稱熱休克蛋白32，是體內(nèi)血紅素代謝主要的起始酶與限速酶。在機(jī)體處于應(yīng)激、創(chuàng)傷、炎癥反應(yīng)以及缺血再灌注損傷時可以通過抗炎、抗氧化、抗凋亡起到對于機(jī)體的保護(hù)作用。青蒿琥酯(ART)是青蒿素的衍生產(chǎn)物，主要應(yīng)用治療重癥瘧疾以及腦型瘧疾，相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)ART具有抗腫瘤以及一定的抗炎作用〔2〕，但對于其具體的抗炎機(jī)制并不十分清楚。本文旨在通過檢測ART干預(yù)后HO-1表達(dá)情況，探討ART對老齡膿毒癥小鼠急性肝損傷的作用機(jī)制，為其臨床防治膿毒癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑 ART粉針劑購于桂林南藥股份有限公司，HO-1抑制劑鋅普林原IX(ZnPP IX)(sigma，美國)，小鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6 ELISA檢測試劑盒購于藍(lán)基生物科技有限公司。Western印跡以及免疫組化抗體，兔抗小鼠HO-1多克隆抗體(Santa Cruz，美國)。

1.2方法

1.2.1動物模型及分組方法 72只雄性昆明小白鼠，18～22周鼠齡，體重25～30 g，由哈醫(yī)大一院動物實驗中心提供，小白鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、膿毒癥組(CLP組)、ART干預(yù)組(ART組)、HO-1抑制劑(ZnPP)組，每組18只。各組小鼠分別按6、12、24 h處死時間點(diǎn)分為三個亞組，每組6只。sham組與CLP組術(shù)前1 h腹腔內(nèi)注射等劑量生理鹽水，ART干預(yù)組術(shù)前1 h腹腔內(nèi)注射ART(15 mg/kg)〔3〕，ZnPP組術(shù)前1 h腹腔內(nèi)注射ART(15 mg/kg)后再注射ZnPP溶液(40 μmol/kg)。造模4 h后sham組、CLP組、ZnPP組分別給予生理鹽水1次，ART組給予等體積ART 1次。膿毒癥造模方法參照傳統(tǒng)CLP模型方法〔4〕，小鼠術(shù)前12 h禁食，自由進(jìn)水，戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定小鼠，術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒，于腹正中線做長約1 cm切口，打開腹膜，分離盲腸，用3～0絲線在距盲腸根部1/3處結(jié)扎，結(jié)扎后保持腸道通路正常，用7號針頭分別于盲腸近段和末端各穿一孔，避免穿刺出血，擠出少許糞便于腹腔內(nèi)，回納盲腸，分層縫合腹腔。術(shù)后即刻背部皮下注射生理鹽水1 ml以補(bǔ)充術(shù)中液體流失〔5〕。假手術(shù)組僅做開腹，分離盲腸遠(yuǎn)端，但不結(jié)扎不穿孔關(guān)腹。術(shù)后各組小鼠分籠飼養(yǎng)，不禁食不禁水。

1.2.2標(biāo)本采集 分別于造模后6、12、24 h眼球取血法收集小鼠血液1 ml，3 000 r/ min，10 min離心后取上清于-80℃冰箱保存。取血后脫頸法處死小鼠，迅速打開腹腔，分離肝臟組織。取相同位置肝組織，一部分-80℃冰箱凍存，用于肝組織HO-1蛋白表達(dá)檢測。另一部分肝組織4％多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，以備光鏡下檢測肝臟病理學(xué)改變和免疫組化法檢測肝組織中HO-1表達(dá)情況。

1.3各項指標(biāo)檢測 ①應(yīng)用FR-40全自動生化分析儀檢測6、12、24 h血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平。②ELISA法檢測6、12、24 h血清中TNF-α與IL-6水平，具體操作按ELISA試劑盒說明書要求進(jìn)行。③Western印跡法檢測24 h HO-1在肝臟的表達(dá)。-80℃冰箱取出凍存肝組織，稱重30 mg，裂解液裂解，制備肝組織勻漿。提取蛋白并純化，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，各取40 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，80 V、3 h電泳后轉(zhuǎn)入硝酸纖維素膜，應(yīng)用2％脫脂奶粉(PBS稀釋，pH7.14)4℃封閉1 h后滴加HO-1(1∶1 00稀釋)一抗過夜，次日3次洗膜后應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育后顯影、洗片。

1.4免疫組化法檢測24 h亞組HO-1在肝臟的表達(dá) 肝組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切厚度5 μm的切片后進(jìn)行脫蠟，枸櫞酸鈉溶液抗原修復(fù)，過氧化氫抗原封閉10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，HO-1兔抗小鼠多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃孵育過夜，次日PBS沖洗3次，每次5 min，滴加羊抗兔二抗，37℃溫箱孵育1 h后PBS沖洗3次，DAB法顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡200倍下觀察肝臟HO-1表達(dá)情況。

1.5肝組織24 h亞組病理學(xué)損傷情況 肝組織4％多聚甲醛固定后梯度酒精脫水，脫鈣后石蠟包埋，切片(切片厚度5 μm)，行HE染色，在光鏡200倍下觀察肝臟病理學(xué)變化。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠血清ALT、AST水平比較 sham組ALT、AST水平基本處于正常范圍，與sham組相比，CLP組小鼠各時相ALT、AST水平升高明顯(P<0.05)，以24 h亞組ALT、AST升高最為顯著。與CLP組相比，ART組血清ALT、AST水平顯著降低(P<0.05)。與ART組相比，ZnPP組各時相ALT、AST水平升高(P<0.05)，ZnPP組與CLP組各時相ALT、AST表達(dá)水平相似。見表1，表2。

表1 各組小鼠血清ALT水平比較

表2 各組小鼠血清AST水平比較

2.2各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 sham組TNF-α、IL-6水平基本處于正常范圍。與sham組相比，CLP組小鼠各時相TNF-α、IL-6水平升高明顯(P<0.05)，以24h亞組TNF-α、IL-6升高最為顯著。與CLP組相比，ART干預(yù)可以顯著降低TNF-α，IL-6水平(P<0.05)。與ART組相比，ZnPP組各時相TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)，ZnPP組與CLP組各時相TNF-α、IL-6表達(dá)水平相似。見表3，表4。

表3 各組小鼠血清TNF-α水平比較

表4 各組小鼠血清IL-6水平比較

2.3Western印跡法檢測24 h亞組HO-1在肝臟表達(dá)情況 Sham組HO-1幾乎沒有表達(dá)，CLP組臟HO-1表達(dá)水平較Sham組升高，可見清晰條帶(P<0.05)；與CLP組相比，ART組肝臟HO-1表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與ART組相比，ZnPP組肝臟HO-1水平表達(dá)下降，但與CLP組表達(dá)水平相似。見圖1。

2.4免疫組化法檢測24 h亞組HO-1在肝臟表達(dá)情況 HO-1免疫組化陽性結(jié)果為黃染顆粒，HO-1表達(dá)在肝臟細(xì)胞質(zhì)中。sham組肝臟HO-1表達(dá)較少，CLP組肝臟HO-1表達(dá)增加，ART組肝臟HO-1表達(dá)明顯增多，ZnPP組肝臟HO-1表達(dá)與CLP組相似。見圖2。

2.5各組小鼠肝臟24 h亞組病理情況 光鏡下sham組肝組織無明顯病理損傷，肝實質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，肝竇結(jié)構(gòu)清晰，無明顯充血，無炎性細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞無腫脹，無嗜酸性變性和壞死。CLP組肝細(xì)胞壞死腫脹，部分肝竇結(jié)構(gòu)不清晰，肝竇以及匯管區(qū)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，可見充血壞死。ART組肝臟炎癥減輕，肝細(xì)胞變性、壞死減少，肝竇、匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤減輕，充血減少。ZnPP組肝臟病理結(jié)果與CLP組相似。見圖3。

圖2 免疫組化法HO-1在肝臟表達(dá)情況(DAB，×200)

圖1 Western印跡法檢測肝臟HO-1表達(dá)情況

圖3 光鏡下肝臟病理學(xué)損傷情況(HE，×200)

3 討 論

膿毒癥是ICU老年患者死亡的重要原因〔6〕，可進(jìn)展成嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克甚至誘發(fā)多器官功能障礙。在受累器官中，肝臟是最常受損的器官之一。肝臟內(nèi)富含豐富的酶、凝血因子和組織蛋白質(zhì)，是機(jī)體合成、代謝、解毒的主要場所。當(dāng)膿毒癥誘發(fā)肝臟功能受損時，機(jī)體會出現(xiàn)嚴(yán)重的甚至不可逆的結(jié)果〔7〕。膿毒癥發(fā)生時，機(jī)體會出現(xiàn)炎性因子過量釋放，補(bǔ)體的激活，氧化還原反應(yīng)的失衡，凝血系統(tǒng)與神經(jīng)體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)的紊亂，上述因素共同作用使得單獨(dú)控制某方面因素?zé)o法有效抑制膿毒癥的進(jìn)展。關(guān)于膿毒癥研究的各種假說很多，其中最為重要的一個假說為促炎與抗炎反應(yīng)的失衡(SIRS/CARS)。膿毒癥發(fā)生早期主要是促炎因子的過度釋放，使得全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)占據(jù)主導(dǎo)作用；而膿毒癥發(fā)生的晚期往往是因機(jī)體吞噬殺菌活性減弱，抗原遞呈功能受抑的代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)作用的增強(qiáng)作為主導(dǎo)。因此能否控制炎癥反應(yīng)的失衡，即在膿毒癥早期抑制過量炎性因子的釋放以及在膿毒癥晚期促進(jìn)抗感染免疫功能的恢復(fù)是能否控制膿毒癥進(jìn)展的重要因素之一。有研究顯示在動物實驗中通過上調(diào)抗炎因子IL-10以拮抗促炎因子的過度釋放起到了對于機(jī)體的保護(hù)作用。上調(diào)炎性因子IL-7能夠促進(jìn)膿毒癥晚期免疫功能的恢復(fù)。同樣具有保護(hù)作用的不僅僅是一些抗炎因子，相關(guān)文獻(xiàn)研究證實通過外源性物質(zhì)作用體內(nèi)或通過誘導(dǎo)內(nèi)源性物質(zhì)的釋放可以減輕膿毒癥時的臟器損傷。外源性的物質(zhì)包括藥物，一些氣體分子例如氫氣(H2)、硫化氫(H2S)、一氧化碳(CO)等，而內(nèi)源性物質(zhì)包括Toll-4樣受體，乙酰膽堿酯能受體和一些酶類等。

HO-1正是在膿毒癥發(fā)生時保護(hù)機(jī)體的酶學(xué)之一。HO-1是血紅素分解代謝的限速酶，其分解血紅素的產(chǎn)物包括Fe2+，膽綠素以及CO。HO有三種同工酶，分別為HO-1、HO-2和HO-3。HO-2和 HO-3主要在生理情況下作用于體內(nèi)〔8〕，而HO-1在病理情況下釋放。大量文獻(xiàn)研究顯示HO-1及其代謝產(chǎn)物對于膿毒癥發(fā)生時的機(jī)體具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的保護(hù)作用。除血紅素外，某些重金屬、熱休克、高氧、低氧、紫外線輻射、內(nèi)毒素等均可誘導(dǎo)HO-1 的產(chǎn)生〔9〕。HO-1廣泛分布于各個組織中，在肝臟中HO-1的分布尤為明顯。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激損傷時HO-1在肝臟表達(dá)大量上調(diào)，不僅僅分布于Kuffer細(xì)胞，在肝實質(zhì)以及間質(zhì)細(xì)胞中均有明顯表達(dá)。HO-1的上游調(diào)節(jié)產(chǎn)物活化蛋白-1(AP-1)以及核因子E2相關(guān)因子2(Nrf-2)可以促進(jìn)HO-1釋放〔10〕，HO-1通過核轉(zhuǎn)錄蛋白(NF)-κB、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)下的P38、Jun氨基末端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)等通路起到抗炎、抗氧化、抗凋亡作用。Morse等〔11〕研究表明HO-1可以抑制NF-κB以及MAPK通路阻斷炎癥反應(yīng)的發(fā)生，減輕TNF-α與IL-6的釋放。南川川等〔12〕研究表明HO-1對于膿毒癥小鼠血栓形成有抑制作用，并且HO-1能夠防止內(nèi)皮細(xì)胞損傷，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝臟凝血系統(tǒng)功能的恢復(fù)。Ryter等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)HO-1可以減少肝組織丙二醛(MDA)形成，促進(jìn)肝臟超氧化物歧化酶(SOD)產(chǎn)生，修復(fù)肝組織中氧化還原反應(yīng)的失衡，減輕膿毒癥時肝臟的氧化損傷。Ke等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)HO-1可以抑制Fas通路減輕肝損傷時肝細(xì)胞的凋亡。上述研究均已證實HO-1對于膿毒癥時受損肝臟的保護(hù)作用。

目前對于膿毒癥基礎(chǔ)研究與藥物研究都有很多，人們在研發(fā)一些新藥治療膿毒癥的同時，一些中醫(yī)中藥和一些傳統(tǒng)意義上的“老藥”也成為研究的新熱點(diǎn)。ART正是這些藥物中的一種，目前臨床主要應(yīng)用于重癥瘧疾、腦型瘧疾和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療中。ART對于耐藥性瘧疾的治療更是起到了良好效果，其在瘧疾治療的作用于地位目前尚無可替代。除此以外大量的研究發(fā)現(xiàn)ART具有良好的抗腫瘤作用，ART對于胃癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等均有較好的抗腫瘤效應(yīng)，考慮其機(jī)制可能是調(diào)控氧化還原反應(yīng)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡〔15〕。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)ART同樣具有抗炎作用，曹紅衛(wèi)等〔16，17〕研究報道ART對于膿毒癥大鼠急性肺損傷以及膿毒癥大鼠急性肝損傷均有保護(hù)作用，ART可以協(xié)同碳?xì)涿赶╊惪股匕l(fā)揮抗炎作用〔18〕。ART的免疫調(diào)節(jié)作用很早前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是對于ART更具體更深入的抗炎作用研究仍舊缺乏。ART是否通過某些具體通路減輕炎癥反應(yīng)，起到減輕膿毒癥臟器損傷的作用。而本研究結(jié)果也部分揭示了ART的抗炎作用通路，發(fā)現(xiàn)了ART可以通過上調(diào)HO-1發(fā)揮抗炎作用。

本研究證實制備CLP模型可以誘發(fā)小鼠急性肝損傷的發(fā)生。肝臟病理學(xué)損傷在24 h最為明顯，肝臟中HO-1表達(dá)水平上調(diào)。而給予ART干預(yù)治療后小鼠血清炎癥因子水平下降，肝臟酶學(xué)損傷減輕，病理學(xué)中肝臟結(jié)構(gòu)清晰，肝竇以及匯管區(qū)充血減輕，炎細(xì)胞浸潤減少，肝細(xì)胞變性壞死損傷程度減輕。ART具有上調(diào)HO-1的作用。通常情況下，當(dāng)炎癥反應(yīng)發(fā)生時，機(jī)體自身會釋放內(nèi)源性HO-1起到受損臟器的保護(hù)作用，給予ART會上調(diào)HO-1的表達(dá)，起到外源性促進(jìn)HO-1釋放作用。應(yīng)用HO-1阻滯劑ZnPP后可以同時抑制機(jī)體內(nèi)源性與外源性HO-1的釋放。ART通過HO-1通路來減輕膿毒癥時炎癥反應(yīng)、起到器官功能保護(hù)的作用。ART是青蒿素的衍生物，藥理作用相同，但ART是青蒿素的升級產(chǎn)品。青蒿素只能通過口服途徑給藥，而ART可以通過靜推以及肌注途徑給藥，這對危重病人更容易實現(xiàn)。盡管ART目前主要應(yīng)用于重癥瘧疾以及腦型瘧疾的治療，但我們的研究通過動物模型證實ART也可能對其他原因?qū)е碌哪摱景Y(如腹腔感染等)治療有效，并從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上證實ART通過調(diào)節(jié)HO-1通路來發(fā)揮抗炎作用，也可能為后續(xù)研究提供有益幫助和借鑒。

4 參考文獻(xiàn)

1Martin GS，Mannino DM,Eaton S,etal.The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000〔J〕.N Engl J Med，2003；348(16)：1546-155.

2梁愛華，薛寶云，王金華，等.靑蒿琥酯對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性因子合成抑制作用的研究〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2001；8(5)：262-5.

3王 寧，劉 鑫，周 紅，等.青蒿琥酯對盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用〔J〕.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2008；13(10)：1095-8.

4Rittirsch D,Huber-Lang MS,Flierl MA,etal.Immunodesign of experimental sepsis by cesal ligation and puncture〔J〕.Nat Protoc,2009;4(1):31-6.

5Caldwell CC，Martignoni A，Leonis MA，etal.Ron receptor tyrosine kinase-dependent hepatic neutrophil recruitment and survival benefit in a murine model of bacterial peritonitis〔J〕.Crit Care Med，2008；36(5)：1585-93.

6Coopersmith CM，Wunsch H,Kink MP,etal.A comparison of critical care research funding and the financial burden of critical illness in the United States〔J〕.Crit Care Med，2012；40(4)：1072-9.

7欒正剛，馬曉春.膿毒癥相關(guān)肝損傷綜述〔J〕.中國實用外科雜志，2012；32(11)：959-61.

8Trakshel GM，Maines MD.Multiplicity of heme oxygenase isozymes.HO-1 and HO-2 are different molecular species in rat and rabbit〔J〕.J Biol Chem，1989；264(2)：1323-8.

9Yoshida T，Sato M.Posttranslation and direct integration of heme oxygenase into microsomes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1989；163(2)：1086-92.

10MacGarvey NC，Suliman HB,Bartz RR,etal.Activation of mitochondrial biogenesis by heme oxygenase-1-mediated NF-E2-related factor-2 induction rescues mice from lethal Staphylococcus aureus sepsis〔J〕.Am J Respir Crit.Care Med，2012；185(8)：8519-619.

11Morse D，Lin L，Choi AM，etal.Heme oxygenase-1，a critical arbitrator of cell death pathways in lung injury and disease〔J〕.Free Radic Biol Med，2009；47(1):1-12.

12南川川，孟祥林，費(fèi)東升，等，血紅素氧合酶-1對老齡膿毒癥大鼠微循環(huán)及肝臟功能的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(7)：1403-6.

13Rtter SW，Choi AM.Heme oxygenase-1/carbon monoxid：novel therapeutic strategies in critical care medicine〔J〕.Curr Drug Targets，2010；11(12)：1485-94.

14Ke B，Buelow R，Shen XD，etal.Heme oxygenase-1 gene transfer prevents CD95/ Fas ligand-mediated apoptosis and improves liver allograft survival via carbon monoxide signaling pathway〔J〕.Hum Gene Ther，2002；13(10)：1189-99.

15母 佩，張厚德，杜冀暉.活性氧在青蒿素及其衍生物抗腫瘤作用機(jī)制中的研究進(jìn)展〔J〕.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2013；19(16)：13-4.

16曹紅衛(wèi)，郭毅斌，魏利召，等.青蒿素對于膿毒癥大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化損傷影響.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2006；11(8)：911-14.

17曹紅衛(wèi)，郭毅斌，魏利召，等.青蒿素對膿毒癥大鼠肺損傷的保護(hù)作用.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007；29(10)：951-4.

18Jiang W，Li B,Zheng X，etal.Artesunate in combination with oxacillin protect sepsis model mice challenged with lethal live methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) via its inhibition on proinflammatory cytokines release and enhancement on antibacterial activity of oxacillin〔J〕.Int Immunopharmacol,2011;11(8):1065-73.