張桂芳 王 穎 郭希娟 張東杰

(國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319)

國外近年有不少有關瓦松黃酮粗提取物生物活性的報道〔1～3〕?，F(xiàn)有研究表明，瓦松屬植物中含有大量草酸以及黃酮類、多糖類、有機酸類、三萜、甾醇類等多種活性成分〔4～6〕。中國作為瓦松資源最豐富的國家之一〔7〕，開發(fā)利用瓦松的黃酮類活性物質和藥用功效非常有價值。本文擬以四氧嘧啶誘發(fā)的糖尿病大鼠為模型，探討瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠血脂和臟器的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SD雄性大鼠，等級為無特定病原體級(SPF)，鼠齡5 w，體重(150±10)g，購自哈爾濱醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院試驗動物中心。

1.2實驗材料及試劑 瓦松全草：購自本地藥店；蘆丁標準品：上海滬宇生物試劑公司；四氧嘧啶(Alloxan，ALX)：上海億欣生物科技有限公司；硝酸鋁、亞硝酸鈉、乙醚、甲醇、氯仿等均為國產分析純。

1.3儀器與設備 T6系列紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；DGG-9053A型鼓風干燥箱(上海森信試驗儀器有限公司)；RE5298型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；怡成血糖測試儀及測定試紙(北京怡成生物電子技術有限公司)；LGR20-W型臺式高速冷凍離心機(北京京立離心機有限公司)；M149928型全自動干式生化分析儀(日本富士)動物專用(北京中西遠大科技有限公司)。

1.4實驗方法

1.4.1瓦松黃酮粗提物制備方法 在前期提取研究的基礎上，采用熱水回流浸提的方法制備瓦松黃酮粗提物(具體工藝另文發(fā)表)，得到的瓦松黃酮提取液在60℃下蒸發(fā)濃縮至膏狀物，浸膏得率約為27.6%。以蘆丁為標準品，通過NaNO2-Al(NO3)比色法〔8〕測定的總黃酮含量為834.8 mg/100 g。試驗樣品在-20℃下保存?zhèn)溆茫褂们跋♂尦尚枰臐舛取?/p>

1.4.2造模方法 試驗大鼠馴養(yǎng)1 w后，在糖尿病誘發(fā)前禁食不禁水14～16 h；誘發(fā)當日，60只大鼠均通過腹腔注射ALX來誘發(fā)糖尿病，初次注射量為80 mg/kg體重，次日追加注射量為60 mg/kg體重；注射72 h后進行尾部靜脈采血測定空腹血糖值，血糖值≥11.1 mmol/L的大鼠被認定糖尿病誘發(fā)成功〔9〕。

1.4.3分組與給藥方法 大鼠糖尿病誘發(fā)成功后隨機選取40只糖尿病大鼠和10只正常大鼠進行試驗，分成5組，分別為正常組，模型組，低劑量組，中劑量組和高劑量組。給藥方法為灌胃給藥(ig)，每日1次，連續(xù)給藥28 d；試驗動物分組和藥劑分配方法為：正常組0.9%生理鹽水；模型組0.9%生理鹽水；低劑量組20 mg/kg瓦松黃酮粗提物；中劑量組40 mg/kg瓦松黃酮粗提物；高劑量組80 mg/kg瓦松黃酮粗提物，劑量均為20 ml/kg。

1.5實試驗動物樣本的采集方法

1.5.1血液樣本的采集 灌胃實驗結束后，所有實驗大鼠禁食14～16 h后在放松的狀態(tài)下用過量的乙醚致昏，確定昏迷后將大鼠四肢固定在解剖臺上，頭部用裝有乙醚棉球的容器扣住，血液樣品來自心臟動脈血，打開胸腔后用無菌注射器刺入右心室，緩慢抽取15 ml左右的血液樣本后迅速放入冰浴中靜置冷卻15～20 min，然后在溫度4℃速度3 000 r/min的條件下離心15 min，吸取上層血清于封閉試管內在-70℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2臟器樣本的采集 血液樣本采集后，迅速從大鼠體內采取肝臟、脾臟和胸腺樣本，編號后清除掉臟器周圍結締組織，再用消毒后的生理鹽水進行洗凈，放在濾紙上吸除多余水分后稱重并記錄，然后迅速放入冰浴中。編號后進行分類存放，所有樣本均在-70℃溫度下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3血液脂質指標的測定方法 心臟動脈血經離心分離得到的血清通過生化分析儀進行檢測，檢測項目包括：①血清谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)酶活性;②血清谷氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)酶活性;③血清總膽固醇(TC)濃度;④血清甘油三酯(TG)濃度；⑤血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度；⑥血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)濃度，通過Friedewald’s公式計算得到：LDL-C=TC-HDL-C-TG/5〔10〕；⑦動脈粥樣硬化指數(shù)(AI)，通過公式計算得到：AI=(TC-HDL-C)/ HDL-C〔11〕。

1.5.4臟器指數(shù)的測定 實驗結束前稱取大鼠體重計算臟器系數(shù)，臟器指數(shù)=某個臟器的濕重與單位體重的比值，通常是每100 g體重中某臟器所占的重量。

2 結 果

2.1瓦松黃酮粗提物對試驗大鼠血液脂質指標的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清TC(P<0.05)、TG、LDL-C含量(P<0.01)和AI值(P<0.01)升高，而血清HDL-C含量明顯降低；與模型組大鼠相比，經過28 d的灌胃實驗，瓦松黃酮試驗組大鼠的血清TC含量、TG含量、LDL-C含量和AI值均有所下降，而血清HDL-C含量有所升高；其中高劑量組大鼠的血清TC含量(P<0.05)，中、高劑量組大鼠的血清LDL-C(P<0.01)含量和AI值(P<0.01)不僅顯著優(yōu)于模型對照組，同時與正常組大鼠接近。見表1。

2.2瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠血清GOT和GPT酶活性的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清GOT(P<0.05)和GPT(P<0.01)的酶活性顯著增加；與模型組大鼠相比，經過28 d的灌胃實驗，瓦松黃酮試驗組大鼠血清GOT和GPT酶活性(P<0.05)均有所降低，見表2。

表1 對試驗大鼠的血清脂質指標水平的影響±s，n=10)

表2 對試驗大鼠血清GOT和GPT活性的影響±s，n=10，U/L)

2.3瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠臟器系數(shù)的影響 與正常組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)(P<0.05)、脾臟指數(shù)(P<0.01)和胸腺指數(shù)(P<0.05)明顯降低；與模型組大鼠相比，經過28 d的灌胃實驗，瓦松黃酮試驗組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所升高。其中瓦松黃酮中、高劑量組大鼠脾臟指數(shù)與模型組差異顯著(P<0.01)。見表3。

表3 對試驗大鼠肝臟、脾臟和胸腺指數(shù)的影響±s，n=10，g/100 g)

3 討 論

正常狀態(tài)下，脂代謝在肝臟中保持著動態(tài)平衡。糖尿病發(fā)生后，由于胰島素的分泌不足，導致體內糖代謝紊亂，糖異生明顯增加，組織蛋白及脂質大量分解，肝臟攝取、轉運脂質的能力開始降低，導致血漿中的脂質水平明顯增高，從而也導致了諸如高脂血癥、酮癥酸中毒、高脂蛋白血癥等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生〔12～14〕。本實驗結果提示瓦松黃酮粗提物具有降低糖尿病大鼠血脂水平和動脈硬化風險的作用。

血清GOT和GPT的活性是衡量肝臟損傷情況的重要指標〔15〕；本研究結果提示瓦松黃酮粗提物對糖尿病大鼠的肝損傷具有一定的修復作用。糖尿病是一種慢性代謝障礙性疾病，持續(xù)的高血糖會產生一系列的生理病理反應，血中糖、脂、氨基酸濃度升高，結果會導致許多器官功能失調〔16～18〕。臟器指數(shù)是評價臟器生理功能的重要指標，可以較為宏觀地反映臟器的生長狀況。本研究結果提示在糖尿病誘發(fā)后大鼠的臟器生長受損，導致大鼠臟器重量下降；通過28 d的灌胃瓦松黃酮粗提物，雖然肝臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與模型對照組相比統(tǒng)計學上無顯著性差異，但是瓦松黃酮粗提物各組大鼠的脾臟指數(shù)顯著升高；脾臟和胸腺是人體主要的免疫器官主要功能是參與免疫反應，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心〔19〕，結果提示瓦松黃酮粗提物對增強機體免疫力具有一定的作用。

本研究結果提示瓦松黃酮粗提物能夠治療糖尿病所引起的高脂血癥，對糖尿病型肝功能損傷和其他臟器的損傷有一定修復作用。對于瓦松黃酮粗提物的純化和鑒定，以及進一步的藥理作用和安全性有待進一步深入研究。

4 參考文獻

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