李長興 祁存芳 李建華 代冬芳 黃明玉 唐延軍

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，青海 西寧 810001)

流行病學(xué)調(diào)查表明，阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病與女性雌激素水平降低、缺乏有關(guān)〔1，2〕。臨床試驗表明，雌激素替代治療可以改善AD患者的認知能力，但鑒于可能出現(xiàn)的嚴重副作用，人們開始關(guān)注具有雌激素效應(yīng)、并能防止雌激素替代治療出現(xiàn)的副作用的植物雌激素〔3〕。大豆異黃酮是從大豆中提取出來的具有弱雌激素樣作用的異黃酮類化合物，其中染料木素是大豆異黃酮中作用最強的一種化學(xué)物質(zhì)〔4，5〕。本研究試圖通過觀察雌激素去除后腦部海馬區(qū)乙酰膽堿(Ach)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)及5-羥色胺(HT)遞質(zhì)含量的變化，及染料木素的干預(yù)作用，探討染料木素影響學(xué)習記憶功能的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用12周齡健康雌性SD大鼠30只，體重180～200 g (蘭州大學(xué)動物實驗中心提供)。

1.2AD動物模型制備 β-淀粉樣肽(Aβ)由美國Sigma公司提供。用生理鹽水將Aβ1～40稀釋成10 μg/μl，37℃孵育1 w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ1～40。SD大鼠10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于立體定位儀上，常規(guī)備皮消毒，切開頭部皮膚，暴露硬腦膜。定位海馬齒狀回背側(cè)細胞帶(前囟后3.3 mm，旁開1.5 mm，顱骨表面下3.3 mm)。微量進樣器自腦表面垂直進針，緩慢將Aβ1～401 μl(10 μg/μl)注入，注射速度為5 μl/h，留針0.5 h，使Aβ1～40充分浸潤局部組織，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3動物分組和藥物處理 隨機分為假手術(shù)組(Sham)、卵巢切除組(Ovx)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0組(Ovx+Est)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0+染料木素1.0組(Ovx+Est+Gen1.0)、卵巢切除+17β-雌二醇1.0+染料木素10.0組(Ovx+Est+Gen10.0)，每組6只。大鼠經(jīng)氯胺酮腹腔注射麻醉后，摘除雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組(Sham)手術(shù)過程與切除組相同，但不切除卵巢而只切除卵巢周圍小塊脂肪組織。隔日皮下注射給藥21 d后取大鼠海馬及子宮組織。Ovx+Est組給予1.0 mg/kg體重17β-雌二醇；Ovx+Est+Gen1.0組給予1.0 mg/kg體重的17β-雌二醇和1.0 mg/kg體重Gen；Ovx+Est+Gen10.0組給予1.0 mg/kg體重的17β-雌二醇和10.0 mg/kg體重Gen，上述藥品溶媒均為芝麻油。Sham組、Ovx組每天給予等體積的芝麻油。

1.4Morris水迷宮測定 待Aβ1～40注射2 w后再測水迷宮潛伏期。即記錄大鼠從入水到找到并爬上平臺的時間，此時間稱逃避潛伏期。每一時間段內(nèi)4次潛伏期的算術(shù)平均數(shù)為這一時段的成績進行統(tǒng)計分析。

1.5標本取材、神經(jīng)遞質(zhì)含量和活性檢測 實驗各組藥物處理21 d，麻醉后快速斷頭取腦迅速分離海馬。同時分離大鼠的子宮并稱重，作為觀察雌激素作用的指標(子宮系數(shù)=子宮濕重/大鼠體重)。海馬區(qū)Ach的測定采用酶聯(lián)免疫法；5-HT，NE，DA的測定采用高效液相(HPLC)測定。

2 結(jié) 果

2.1大鼠子宮濕重測定結(jié)果 與Sham組比較，Ovx組子宮重量明顯降低(P<0.05)。與Ovx組比較，Ovx+Est組的子宮重量增加(P<0.05)；與Ovx+Est組相比，Ovx+Est+Gen1.0組子宮重量顯著降低(P<0.05)，但Ovx+Est組與ovx+Est+Gen10.0組之間無顯著性差異(P>0.05)。表1。

2.2Morris水迷宮結(jié)果 與Sham組相比，Ovx組AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期明顯增長(P<0.01)；Ovx+Est組AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期與Ovx組相比明顯縮短(P<0.01)；與Ovx+Est組相比，Ovx+Est+Gen1.0組AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期明顯增長；Ovx+Est+Gen10.0組AD大鼠的水迷宮逃避潛伏期縮短，但與Ovx+Est組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表1 AD模型大鼠子宮重量與子宮系數(shù)比較±s)

表2 AD模型大鼠逃避潛伏期比較±s)

2.3神經(jīng)遞質(zhì)含量測定 與Sham組相比，Ovx組神經(jīng)遞質(zhì)含量均降低；Ovx+Est組與Ovx組相比，Ovx+Est組神經(jīng)遞質(zhì)含量明顯增加(P<0.01)，與Ovx+Est組相比，Ovx+Est+Gen1.0組神經(jīng)遞質(zhì)含量均降低；Ovx+Est+Gen10.0組與Ovx+Est組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 AD模型大鼠海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)含量測定±s,n=6)

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查表明，AD的發(fā)病有明顯的性別差異，絕經(jīng)后婦女的發(fā)病率較同齡男性高1.5～3.2倍〔6〕。這可能是老年婦女由于雌激素缺乏而使患AD的危險性增加，即與喪失了雌激素的保護作用有關(guān)〔7，8〕。而男性可繼續(xù)產(chǎn)生睪酮，后者在腦內(nèi)的P450芳香化酶的作用下轉(zhuǎn)變成雌激素〔9〕。臨床試驗表明，絕經(jīng)婦女接受雌激素治療可降低AD發(fā)病的危險性，推遲AD的發(fā)病時間。但長期使用雌激素可增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、卵巢癌的發(fā)病率，限制了它的應(yīng)用。鑒于雌激素替代治療可能出現(xiàn)的嚴重副作用，人們開始關(guān)注具有雌激素效應(yīng)、并能防止雌激素替代治療出現(xiàn)副作用的植物雌激素。研究發(fā)現(xiàn)，從大豆、三葉草、葛根等植物中提取出來的具有雌激素活性的異黃酮類化合物，具有雙重效應(yīng)，在較低劑量時與雌激素競爭產(chǎn)生抗雌激素作用，而在較高劑量時可激活因雌激素不足而未能激活的ER，產(chǎn)生雌激素樣作用〔10〕。

本研究結(jié)果顯示，低劑量染料木素和雌激素同時處理時，可以降低海馬區(qū)Ach、5-HT、NE、DA的含量，拮抗雌激素的上調(diào)作用，同時低劑量染料木素處理組逃避潛伏周期大于單純雌激素處理組。這可能與以下機制有關(guān)：低劑量染料木素可能發(fā)揮雌激素拮抗作用，增加膽堿能M和N受體的結(jié)合位點的數(shù)目，促進Ach與膽堿能受體的結(jié)合；促進突觸前膜對高親和力膽堿的攝??；增加5-HT受體濃度；干擾DA受體介導(dǎo)的神經(jīng)細胞鈣通道改變引起的鈣內(nèi)流，影響AD大鼠學(xué)習記憶功能；大劑量染料木素和雌激素同時處理時，作用與單獨給予雌激素作用相似，可能是通過模擬雌激素而發(fā)揮作用〔11，12〕。

綜上所述，植物雌激素染料木素對AD大鼠具有神經(jīng)保護作用，可提高認知功能；其作為植物雌激素，在制藥、營養(yǎng)保健品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 參考文獻

1賈 安.阿爾茨海默病的雌激素替代治療進展〔J〕.中國醫(yī)師進修雜志，2008；31(24)：73-5.

2張文眾，李 寧，李 蓉.大豆異黃酮的雌激素樣作用研究〔J〕.衛(wèi)生研究，2008；37(6)：707-9.

3Yokooji T，Kawabe Y，Mori N，etal.Effect of genistein，a natural soy isoflavone，on the pharmacokinetics and intestinal toxicity of irinotecan hydrochloride in rats〔J〕.J Pharm Pharmacol，2013；65(2)：280-91.

4楊期東，周 琳.中國阿爾茨海默病的流行病學(xué)特征〔J〕.中國臨床康復(fù)，2004；8(31)：6982-3.

5Bieber EJ，Cohen DP.Estrogens and hormone replacement therapy：Is there a role in the preservation of cognitive function?〔J〕.Intern J Fertil Womens Med，2001；46(4)：206-9.

6Henderson V W，Benke K S，Green R C，etal.The protective effect of estrogen on Alzheimer's disease risk is associated with age〔J〕.Neurobiol Aging，2002；231(1)：S290.

7陳秋生，洪新如，宋巖峰.芳香化酶、雌激素與雄性生殖〔J〕.中國男科學(xué)雜志，2008;22(7)：55-7.

8朱迪娜，王 磊，王思彤，等.植物雌激素的研究進展〔J〕.中草藥，2012;43(7)：1422-9.

9陳 多，張 冉，吳春福，等.雌激素改善學(xué)習記憶的機制〔J〕.分子科學(xué)學(xué)報，2002；18(4)：230-4.

10閆 燕，李妍怡.植物雌激素對阿爾茨海默病的作用研究進展〔J〕.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2010；8(3)：348-9.

11Kuwahara R，Kawaguchi S，Kohara Y，etal.Effects of estrogen-related endocrine disrupters on learning and memory in rats〔J〕.J Pharmacol Sci，2010；1121：223P.

12Zurkovsky L，Brown SL，Boyd SE，etal.Estrogen modulates learning in female rats by acting directly at distinct memory systems〔J〕.Neuroscience，2007;144(1)：26-37.