金 宏 劉 威 溫 娜 紀(jì)朋艷 王 爽 齊 玲 劉曉陽(yáng)

(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤在顱內(nèi)腫瘤中發(fā)病率較高，目前治療方法主要以手術(shù)為主，輔以放化學(xué)治療，但都效果不佳，術(shù)后復(fù)發(fā)率、死亡率很高。其中位生存期<1年，且大多數(shù)患者在確診后 2 年內(nèi)死亡〔1〕。五味子作為補(bǔ)益類中藥，在護(hù)肝、提高免疫、抗腫瘤與抗氧化等方面已受到多項(xiàng)證實(shí)。研究表明，木脂素是五味子中主要生物活性成分〔2，3〕，但其對(duì)腦膠質(zhì)瘤中治療作用研究較少。本研究觀察了五味子木脂對(duì)體外培養(yǎng)裸鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，旨在探討五味子木脂素在腦腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中起到的作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640 (Thermo)，小牛血清(Gibco)，五味子木脂素(北華大學(xué)提供)，木瓜蛋白酶(北京鼎國(guó))，四甲基耦氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma)，二甲基亞砜(DMSO)(Thermo)。

1.2提取原代裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞 取新鮮的裸鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織，冰上操作，剔除壞死出血部分，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，將組織剪成1×1 mm2碎塊，置于離心管中，加入木瓜蛋白酶后將離心管置于37℃培養(yǎng)箱中，消化30 min，吸取上清液，加血清終止消化，以300 r/min離心5 min，棄上清后加培養(yǎng)液反復(fù)吹打，過(guò)濾后以300 r/min速度離心5 min，離心再次棄上清，加入含10%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以2×106將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)待用。

1.3培養(yǎng)裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞 將提取細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含10%小牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，將其置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，待細(xì)胞匯合度為 80%～90% 時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代，取傳3代以后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4藥物作用后膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)情況 將五味子木脂素溶解后，取適量藥液加入含5%小牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，配制成終濃度為0、50、100、200 μg/ml的藥物。將裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用胰酶消化后，用含5%小牛血清RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。將細(xì)胞懸液均勻接種于96孔板中，100 μl/孔，置入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化。分別于24、48、72 h棄去上清液，加入含不同濃度的五味子木脂素，每個(gè)藥物濃度重復(fù)5次。藥物作用結(jié)束時(shí)，每孔加入MTT 20 μl，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止細(xì)胞培養(yǎng)，棄去上清液，每孔分別加DMSO 150 μl，震蕩均勻使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度(A)值，用不加細(xì)胞的空白孔調(diào)零。

2 結(jié) 果

不同濃度五味子木脂素作用于裸鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示：隨著藥物濃度的增高，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用，濃度在200 μg/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞的抑制作用最明顯(P<0.01)，說(shuō)明五味子木脂素在高濃度時(shí)可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度五味子木脂素對(duì)裸鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用±s)

3 討 論

神經(jīng)上皮組織腫瘤在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率較高，同時(shí)分類及分型最多〔4〕。其中，又以膠質(zhì)細(xì)胞瘤為最多，約占 50%。目前，手術(shù)治療仍是腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段，但是患者的生存期不高，一直維持在15～22個(gè)月〔5〕。所以，為了提高膠質(zhì)瘤患者的生存率，研究新的治療手段顯得十分迫切。近年來(lái)隨著祖國(guó)醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，中醫(yī)中藥等治療方法已從逐漸過(guò)渡到臨床，并取得了一定治療效果，這些方法可有效縮小腫瘤體積、減少腫瘤血供，提高患者生存率。

五味子是我國(guó)長(zhǎng)期使用的補(bǔ)益類藥物，大量研究證明，五味子中含有的聯(lián)苯環(huán)辛二烯結(jié)構(gòu)的木脂素類物質(zhì)是其主要的生物活性成分〔6～9〕，主要包括五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素等，此類物質(zhì)具有保肝、降酶、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗艾滋病毒和抗癌等多種活性〔10～12〕。研究表明木脂素發(fā)揮抗腫瘤作用主要是通過(guò)清除氧自由基、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化及凋亡、逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多耐藥性、抑制腫瘤血管生成等機(jī)制來(lái)抑制腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。目前對(duì)五味子木脂素在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中是否發(fā)揮抑瘤作用還未見(jiàn)研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)較高濃度五味子木脂素作用裸鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。藥物濃度在200 μg/ml時(shí)，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用最明顯。充分說(shuō)明五味子木脂素在治療腦腫瘤中可能發(fā)揮重要作用。具體該藥通過(guò)何種途徑發(fā)揮抑瘤作用還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到五味子木脂素在高濃度時(shí)可明顯抑制體外腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步肯定了五味子木脂素在抗腫瘤方面的應(yīng)用價(jià)值。下一步，將在此研究的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探索五味子木脂素具體通過(guò)哪種方式發(fā)揮其抗腦膠質(zhì)瘤作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Reifenberger G，Hentschel B，F(xiàn)elsberg J，etal. Predictive impact of MGMT promoter methylation in glioblastoma of the elderly〔J〕.Int J Cancer，2012;131(6)：1342-50.

2程振玉，楊英杰.五味子木脂素提取工藝研究新進(jìn)展〔J〕.吉林化工學(xué)院學(xué)報(bào)，2013;30(1)：18-32.

3陰冠秀，杜 冰，魯旺旺，等.高效液相色譜法測(cè)定南、北五味子中 4 種木脂素含量〔J〕.食品科學(xué)，2011;21(10)：218-21.

4Fuller GN，Scheithauer BW. The 2007 revised world health organization ( WHO) classification of tumours of the central nervous system：newly codified entities〔J〕. Brain Pathol，2007;17( 3)：304-7.

5Guo J，Gao X，Su L，etal.Aptamer-functionalized PEG-PLGA nanoparticles for enhanced anti-glioma drug delivery〔J〕.Biomaterials，2011;32(31)：8010-20.

6楊 磊，馬春慧，祖元?jiǎng)?北五味子木脂素超聲提取工藝〔J〕.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2009;25(增1)：185.

7劉仁俊.五味子化學(xué)成分及藥理作用研究〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥指南，2011;9(32)：169.

8劉國(guó)宇，陳 旭.五味子木脂素類化學(xué)成分及其含量分析方法的研究現(xiàn)狀〔J〕.黑龍江醫(yī)藥，2010;23(2)：228-30.

9王彥涵，高建平，陳道峰.高效液相色譜法測(cè)定五味子屬藥用植物木脂素的含量〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2003;28(12)：1155-9.

10栗 爽，王 冰.HPLC 法測(cè)定不同產(chǎn)地五味子種子中 3 種木脂素類含量〔J〕.江西中醫(yī)藥，2009;40(1)：58-9.

11胡俊揚(yáng)，陸兔林，毛春芹，等.HPLC 法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地五味子中 8 種木脂素類成分〔J〕.中成藥，2012;34(2)：313-6.

12黃文倩，李 麗，肖永慶，等.HPLC 同時(shí)測(cè)定五味子中 6 種木脂素類成分〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011;17(10)：63-6.