施小嬌 金 夢 張曉暄 宋雪松

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院麻醉科，吉林 長春 130021)

異氟烷可誘發(fā)發(fā)育期動物腦神經(jīng)毒性并影響成年后的學(xué)習(xí)記憶功能，七氟烷的研究結(jié)論不一，但已有其麻醉可增加嬰幼兒術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率的報道，其機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明〔1～5〕。學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的海馬神經(jīng)元長時程增強(LTP)是一種突觸可塑性的變化，其誘導(dǎo)和維持中均需要如N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、γ-氨基丁酸(GABA)等受體的激活及相繼的胞內(nèi)激酶級聯(lián)反應(yīng)和核內(nèi)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的改變，由核內(nèi)第三信使介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)變化是海馬神經(jīng)元早期LTP向穩(wěn)定的晚期LTP轉(zhuǎn)化及記憶鞏固的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。大量研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)參與介導(dǎo)上述效應(yīng)，其磷酸化水平下降，引起與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的海馬CA1區(qū)LTP被抑制〔6～8〕。本研究擬觀察不同濃度七氟烷麻醉對大鼠早期認(rèn)知功能的影響以及海馬中磷酸化CREB表達(dá)的變化。

1 材料與方法

1.1動物分組與麻醉模型的建立 SPF級5周齡SD大鼠90只，體質(zhì)量100～110 g，隨機(jī)分為對照組(C組)、1%七氟烷麻醉組(S1組)、2%七氟烷麻醉組(S2組)、2.6%七氟烷麻醉組(S3組)、4.1%七氟烷麻醉組(S4組)。C組單純吸氧6 h，氧流量2.0 L/min，其余各組在與C組相同的氧流量條件下分別給予1%、2%、2.6%和4%七氟烷吸入6 h，待翻正反射恢復(fù)后將大鼠放回飼養(yǎng)籠。

1.2主要儀器與試劑 麻醉氣體監(jiān)測儀(飛利浦S60，荷蘭)；Morris水迷宮實驗裝置(上海軟隆科技發(fā)展公司)；七氟烷揮發(fā)罐(艾伯維醫(yī)療貿(mào)易上海有限公司)；兔抗pCREB抗體(Santa Cruz，美國)

1.3七氟烷吸入麻醉 吸入麻醉過程在一自制麻醉箱內(nèi)進(jìn)行。自制麻醉箱為有機(jī)玻璃材料制成，高、寬、長為25 cm×15 cm×15 cm，用帶有3 mm小孔的篩狀隔板將箱內(nèi)空間分割為上(高15 cm)、下(高10 cm)2部，箱頂近中央分別有一大孔和小孔，大孔嵌裝的氣管導(dǎo)管標(biāo)準(zhǔn)銜接頭，可與麻醉機(jī)螺紋管緊密連接；箱的兩側(cè)面和背面高于隔板2 cm處各有一小孔，每個小孔(包括頂部)分別嵌裝一可與多功能氣體分析儀自動取樣管良好吻合的標(biāo)準(zhǔn)連接頭。實驗時，在麻醉箱底部放置一薄層鈉石灰用以吸收CO2，調(diào)節(jié)麻醉機(jī)(Ohmeda Detax,美國)氧流量(2.0 L/min)和七氟烷蒸發(fā)罐，當(dāng)通過麻醉箱各側(cè)小孔測定箱內(nèi)七氟烷濃度達(dá)到預(yù)定目標(biāo)：S1組1%〔0.5最低肺泡有效濃度(MAC)〕、S2組2%(1 MAC)、S3組2.6%(1.3 MAC)和S2組4.1%(2 MAC)，將大鼠放置于麻醉箱上部隔板上，6 h后關(guān)閉麻醉蒸發(fā)罐，待其麻醉自然消退和清醒；C組僅向箱內(nèi)輸送相同濃度的氧氣6 h，但不開啟七氟烷蒸發(fā)罐。

1.4Morris水迷宮實驗 在七氟烷麻醉后1、2、3、4、5和6 d進(jìn)行。定向航行實驗5 d：每天4次，將大鼠分別從4個象限入水點面向池壁放入水中，記錄60 s內(nèi)尋找到平臺的時間并讓大鼠在平臺上停留10 s，超過60 s未能找到平臺者，用木棒輕柔人為地將其引上平臺并停留在臺上10 s，認(rèn)定其尋找平臺時間為60 s，取4次測定結(jié)果的平均值為當(dāng)天的逃逸潛伏期?？臻g搜索實驗：在七氟烷麻醉后第6天觀察空間探索能力，從水槽內(nèi)移走平臺，自第三象限將大鼠面向槽壁放入水中，記錄60 s內(nèi)在原平臺處穿臺次數(shù)以及在平臺象限(第三象限)內(nèi)的活動時間。

1.5曠場實驗 曠場行為觀察箱為80 cm×80 cm× 60 cm的無頂木箱,箱底用墨線分為25個等份小方格。在七氟烷麻醉后1 d和5 d，自中央格放入大鼠，觀察在2 min內(nèi)穿越的格子數(shù)(3只腳進(jìn)入其他小方格)和直立次數(shù)(兩前腿同時離開底面)。每完成一只大鼠的測試后清理木箱內(nèi)壁和底面，以免大鼠氣味殘留影響下次實驗。

1.6免疫印記分析 于七氟烷麻醉后蘇醒后，每組取6只大鼠在1%戊巴比妥鈉60 mg/kg深麻醉下取左側(cè)海馬，放入勻漿液中低溫勻漿，15 000 r/min， 4℃離心20 min，取上清。按Bradford法測定樣本蛋白濃度后加入4倍樣本緩沖液(250 mmol/L Tris/HCl,0.01% 考馬斯亮藍(lán)-G，8% SDS,200 mmol/L蔗糖,和300 mmol/L Dithiothreitol，pH6.8)，95℃ 5 min變性。30 μg等量的樣本加在10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳(120 V,1.5 h)，然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上(100 mA,2 h)，5%脫脂奶粉封閉30 min后與兔抗pCREB多克隆抗體(1∶400)和β-tubilin多克隆抗體 (1∶1 000) 4℃孵育過夜，TBST沖洗，3×10 min，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔二抗 (1∶1 000)，室溫振蕩孵育1 h，TBST沖洗3×10 min，用NBT/BCIP檢測反應(yīng)條帶，掃描圖像用Image J 軟件(NIH,USA)半定量分析。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS10.0軟件進(jìn)行配對t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)記憶能力比較 與C組相比，麻醉后1、2 d，S1、S2、S3和S4組平均逃逸潛伏期均明顯延長(P<0.05)；S1組平均逃逸潛伏期與C組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；麻醉后3 d，S3和S4組大鼠平均逃逸潛伏期均明顯延長(P<0.05)，麻醉后4 d， S4組平均逃逸潛伏期均明顯延長(P<0.05)，麻醉后5 d，各組平均逃逸潛伏期未見明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組麻醉后不同時間平均逃逸潛伏期的比較(s,±s,n=10)

2.2各組空間搜索能力比較 與C組相比， S1和S2組平均平臺象限停留時間和穿臺次數(shù)之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，S3和S4組明顯減少(P<0.05)。見表2。

2.3各組曠場內(nèi)自發(fā)行為比較 各組麻醉后1和5 d在曠場箱內(nèi)的自發(fā)行為表現(xiàn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4各組海馬磷酸化CREB表達(dá)的影響 與C組(1.0)相比，S2、S3和S4組海馬組織中磷酸化CREB表達(dá)(0.95±0.04、0.74±0.06、0.61±0.05)明顯下降(P<0.05)，而S1組(0.93±0.07)與C組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

表2 各組平臺象限停留時間和穿過平臺次數(shù)的比較±s,n=10)

表3 各組曠場試驗結(jié)果的比較±s,n=10)

圖1 各組海馬磷酸化CREB表達(dá)

3 討 論

學(xué)習(xí)記憶是人類和動物共同的賴以生存的最基本的高級神經(jīng)功能之一，已知人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)的快速發(fā)育期主要在2～3歲，此時期大腦的發(fā)育及改變必將會影響成年后大腦的功能變化。含氟吸入性麻醉藥(如異氟烷和七氟烷)是目前臨床全身麻醉中廣泛使用的一類藥物，特別是七氟烷因起效迅速、無刺激性氣味已廣泛用于嬰幼兒麻醉的誘導(dǎo)和維持。已知單獨應(yīng)用七氟烷麻醉，其MAC為2.05%(ED50)，而吸入濃度達(dá)到1.3MAC(2.6%)時才認(rèn)為達(dá)到麻醉標(biāo)準(zhǔn)(ED95)。

Morris水迷宮實驗是一種能夠客觀評價實驗動物認(rèn)知功能的方法，其中定向航行的逃逸潛伏期可反映獲取空間信息的能力，而空間探索實驗的行為反映了實驗動物對在定向航行實驗訓(xùn)練中所獲取信息的記憶儲存及再現(xiàn)能力。本研究說明較高濃度七氟烷麻醉后大鼠早期學(xué)習(xí)空間信息的能力及記憶功能可能受到了影響，這種學(xué)習(xí)記憶影響僅僅是短暫和早期的。朱霞等〔9〕觀察七氟烷對幼鼠麻醉前的學(xué)習(xí)記憶影響的研究提示在臨床麻醉中盡量減低吸入麻醉藥的濃度可能更安全。

七氟烷，包括其他含氟揮發(fā)性吸入麻醉藥影響生長期的神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育仍未完全闡明，但有研究〔3～5〕指出GABA受體和NMDA受體活性均參與調(diào)節(jié)生長期和成年期神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化，除了引起發(fā)育中的動物腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)異常外，還可能造成其成年后腦神經(jīng)元密度下降以及長期的認(rèn)知功能障礙，此兩種受體也在許多全身麻醉藥作用機(jī)制中發(fā)揮重要作用。磷酸化是細(xì)胞信號通路中轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)控的主要機(jī)制。CREB是最早證實由磷酸化調(diào)控其活性的轉(zhuǎn)錄因子之一，在腦內(nèi)所有細(xì)胞中均有表達(dá)，定位于核內(nèi)并在多種信號分子誘導(dǎo)下調(diào)控大量下游靶基因的表達(dá)。CREB作為一種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化后能夠激活或促進(jìn)一系列與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因表達(dá)，表達(dá)長時間記憶相關(guān)蛋白，在短時間記憶轉(zhuǎn)變?yōu)殚L時間記憶過程中起到關(guān)鍵的分子開關(guān)作用〔10〕。本研究說明CREB磷酸化水平的降低可能參與介導(dǎo)引起幼鼠七氟烷麻醉后學(xué)習(xí)記憶能力下降。CREB可在不同信號通路的激酶作用下實現(xiàn)Ser133磷酸化而活化發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，全身麻醉藥通過興奮GABA受體或抑制NMDA受體引起細(xì)胞內(nèi)激酶級聯(lián)信號傳導(dǎo)通路如cAMP/cAMP-依賴性蛋白激酶A (cAMP-PKA)、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)、CaMⅡ、Ras-胞外信號調(diào)節(jié)激酶-核糖體S6激酶(Ras-ERK-RSK)等的變化，進(jìn)一步引起CREB活性的變化，導(dǎo)致短期內(nèi)學(xué)習(xí)記憶能力的損害。

4 參考文獻(xiàn)

1Lei X,Guo Q,Zhang J.Mechanistic insights into neurotoxicity induced by anesthetics in the developing brain〔J〕.Int J Mol Sci,2012;13(6):6772-99.

2Loepke AW,Soriano SG.An assessment of the effects of general anesthetics on developing brain structure and neurocognitive function〔J〕.Anesth Analg,2008;106(6):1681-707.

3Liang G,Ward C,Peng J,etal.Isoflurance causes greater neurodegeneration than an equivalent exposure of sevoflurance in the developing brain of neonatal mice〔J〕.Anesthesiology,2010;112(6):1325-34.

4Millar K,Asbury AJ,Bowman AW,etal.The effects of brief sevoflurance-nitrous oxide anesthesia upon children’s postoperative cognition and behavior〔J〕.Anesthesia,2006;61:541-7.

5Sun L.Early childhood general anaesthesia exposure and neurocognitive development〔J〕.Br J Anaesth,2010;105(s1):i61-8.

6Meyer CJ,Alenghat FJ,Rim P,etal.Mechanical control of cyclic AMP signalling and gene transcription through integrins〔J〕.Nature Cell Biol,2000;2(9):666-8.

7Schinelli S,Zanassi P,Paolillo M,etal.Stimulation of endothelin B receptors in astrocytes induces cAMP response element-binding protein phosphorylation and c-fos expression via multiple mitogen-activated protein kinase signalin pathways〔J〕.J Neurosci,2001;21(22):8842-53.

8Bing G,Ottavio V,Fabrizio T,etal.Persistent improvement in synaptic and cognitive functions in an Alzheimer mouse model after rolipram treatment〔J〕.J Clin Invest,2004;14(11):1624-34.

9朱 霞，朱貴芹，張勵才.不同濃度七氟醚對幼鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬NR2B Tyr472磷酸化表達(dá)的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報,2013;29(12):1717-20.

10Paramanik V,Thakur MK.Role of CREB signaling in aging brain〔J〕.Arch Ital Biol,2013;151(1):33-42.