陳 懿 葛金文 廖 君 蘇 浩

(湖南中醫(yī)藥大學生理學教研室,湖南 長沙 410208)

近年來，血管新生在缺血性腦梗死中的修復作用已引起廣泛關注。近年來許多研究表明，腦缺血時，血管內皮細胞生長因子(VEGF)作為最重要的血管生成因素之一，表達增加，促使血管形成。在血管生成過程中，VEGF誘導Notch信號系統的表達。Notch信號通路是生物體進化中高度保守的信號轉導通路，作用具有多樣性，參與了正常血管生成、缺血后損傷血管的修復等過程，為腦缺血治療新的生物學靶點〔1,2〕。益氣活血法是臨床上治療缺血性腦卒中常用的中醫(yī)治法。以往研究已證實益氣活血中藥腦泰方促進局灶性缺血腦組織VEGF的表達，有治療性血管新生樣作用〔3〕。本實驗采用線栓法制作局灶性腦缺血大鼠模型，觀察腦泰方對局灶性腦缺血大鼠缺血半暗帶區(qū)Notch信號轉導通路的影響，探討其促進腦缺血損傷后治療性血管新生樣作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1藥物、主要試劑及儀器 腦泰方由黃芪、川芎、地龍等藥物組成，經水煎、醇提后制成浸膏粉(由湖南中醫(yī)藥大學藥學院制劑教研室提取，每1 g浸膏粉含生藥4 g)；Trizol 購自美國INVITROGEN公司， RT-PCR試劑盒購自美國MBI公司。重組人血管內皮抑制素(ED)購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。VEGF、Fk-1、Notch1抗體購自Santa Cruz公司。日本Olympus公司BX51光學顯微鏡及Motic Image Advanced 3.0 圖像分析系統，Biomatra公司Tgradient PCR儀。

1.2動物分組與給藥 65只雄性清潔級成年SD大鼠，體重250～280 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號SCXK(滬) 2008-0016。按隨機數字表法抽取5只大鼠為假手術組(灌胃生理鹽水)，只分離血管，不插入線栓，飼養(yǎng)28 d后取材。其余60只大鼠按隨機數字表法分為模型組(MCAO組，灌胃生理鹽水)、腦泰方提取物組(NTF組，灌胃腦泰方提取物，0.72 g/ml)及NTF+ED(血管內皮抑制素)組，每組20只。參照Longa等〔4〕的方法并加以改進制備大鼠左側大腦中動脈阻塞模型(MCAO)。模型成功的分級標準參考Bederson等〔5〕對栓塞后大鼠的評分標準作神經功能缺失評分，分值在1～3分者入選，死亡不足動物隨機替補。模型成功后24 h腹腔注射恩度(2.5 mg/kg，前3 d每天1次，之后每周2次)。各組再按不同時間點以隨機數字表法再分成4組，每組5只，分別于腦缺血后1、7、14、28 d取材。

1.3RT-PCR法檢測VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA的含量 ①引物合成：引物設計，參考電腦基因庫核苷酸序列資料，由上海生工生物工程公司合成純化。VEGF的引物序列:正義鏈引物：5'-CGCCAAGCCCGGAAGATTAG-3'，反義鏈引物：5'-CCAGGGATGGGTTTGTCGTG-3'。Flk-1的引物序列:正義鏈引物：5'-CTGTGCTGTTTCCTACCCTAATC-3'，反義鏈引物：5'- CTTTACCGTCGCCACTTGAC-3'。Notch1的引物序列: 正義鏈引物: 5'- AATGGAGGGAGGTGCGAAG-3',反義鏈引物：5'-ATGGTGTGCTGAGGCAAGG -3'。GAPDH的引物序列：正義鏈引物：5'-AACTCCCTCAAGATTGTCAG-3'，反義鏈引物：5'-GGGAGTTGCTTGAAGTCACA-3'。②腦組織總RNA的提取，采用異硫氰酸胍法。③PCR產物分析：取5 μl PCR擴增產物，在2.5%的瓊脂糖凝膠電泳上做擴增產物檢測分析，電壓50V，30～45 m，溴乙啶染色。紫外燈下拍攝觀測電泳條帶，激光密度掃描儀掃描底片。計算曲線下峰面積作為PCR產物含量。用下列公式計算VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA的表達水平。產物的含量=Notch1(VEGF、Flk-1)擴增產物的光密度值/參照系統GAPDH擴增產物的光密度值。

1.4Western 印跡法檢測VEGF、Flk-1、Notch1蛋白的表達 Western印跡法檢測VEGF、Flk-1、Notchl的表達：按照總蛋白提取試劑盒進行，提取總蛋白并進行蛋白定量。變性后取40 μg蛋白上樣，經10%SDS-PAGE電泳并電轉膜到PVDF，5%脫脂奶粉封閉1 h后加入相應一抗：小鼠抗大鼠Notchl抗體(濃度1∶100)，兔抗大鼠Flk-1抗體(濃度1∶200)和兔抗大鼠VEGF抗體(濃度1∶200)，4℃過夜，洗膜后加入二抗孵育1 h，ECL顯影，X光片暗室中感光，圖像分析系統進行掃描并記錄光密度強度。設β-actin作為內參對照，結果以IOD值表示。以假手術組的相對灰度值作為標準，其他各組的IOD值分別進行標化，再進行統計學分析。

2 結 果

2.1大鼠缺血周邊區(qū)VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA的表達 假手術組中，VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA均呈低水平的表達；MCAO組中，VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA表達在術后7 d開始升高，14 d 達高峰；NTF組中，同樣在術后7 d VEGF、Flk-1、Notch1 mRNA表達開始升高，14 d 達高峰，并且各時間點比同時相MCAO組升高更明顯(P<0.05)；而在NTF+ED干預組中，VEGF、Flk-1和Notch1 mRNA的表達低于NTF組(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 腦泰方提取物對局灶性腦缺血大鼠VEGF mRNA、Flk-1 mRNA和 Notch1 mRNA 表達的影響±s，n=5)

2.2大鼠腦缺血周邊區(qū)VEGF、Flk-1、Notch1的蛋白表達 MCAO組VEGF蛋白在術后7 d表達開始升高， 14 d達高峰；NTF治療組中，VEGF蛋白表達同樣在術后7 d開始升高，14 d達高峰，且與同時相MCAO組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；而與NTF組比較，NTF+ED組各時相的VEGF蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 腦泰方對缺血腦組織VEGF 蛋白含量的影響±s，n=5)

2.2.1各組Flk-1蛋白表達情況 MCAO組Flk-1蛋白在14 d 表達開始升高，NTF組在術后7、14和28 d Flk-1蛋白表達高于同時相MCAO組，但差異無統計學意義(P>0.05)；而與NTF組比較，NTF+ED組各時相的Flk-1蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，尤其是術后7 d (P<0.01)。見表3。

表3 腦泰方提取物對缺血腦組織Flk-1蛋白含量的影響±s，n=5)

2.2.2各組Notch1蛋白表達情況 MCAO組Notch1蛋白表達在7 d 表達開始升高， 14 d達高峰；NTF治療組中，Notch1蛋白表達在各時相升高顯著，與MCAO組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與NTF組比較， NTF+ED干預組各時相的VEGF蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。見表4。

表4 腦泰方提取物對缺血腦組織Notch1蛋白含量的影響±s，n=5)

3 討 論

缺血性腦損傷是一系列復雜的病理生理過程，其機制尚未完全闡明。MCAO動物模型顯示，血管新生在缺血1～2 w明顯可見，在缺血半暗帶區(qū)最為明顯〔6〕。Marti 等〔7〕的研究表明，MCAO 后24 h 血管內皮細胞開始增生，血管樣結構從軟腦膜和腦實質的血管向缺血區(qū)發(fā)展。本課題組前期研究亦證實，腦缺血后，缺血組織血管新生明顯。血管的新生及調控涉及多種細胞因子和信號通路。近年來認為最重要的是VEGF及Notch信號通路。永久性局灶性腦缺血半暗帶區(qū)的VEGF表達于缺血后2～14 d內持續(xù)增高，新血管的形成始于缺血后6～24 h，并一直延續(xù)28 d〔8〕。炎癥反應及一些藥物可通過VEGF及其受體促進血管發(fā)生及損傷后的恢復〔9,10〕。而VEGF亦可誘導動脈內皮細胞中Notch信號基因表達。研究也發(fā)現Notch信號通路對血管的發(fā)生發(fā)展，包括細胞增殖、遷移、平滑肌分化、血管生成、動靜脈分化等多個方面有重要調控功能〔11〕。Notch信號家族包括Notch受體、配體及其相應的細胞內信號分子。在脊椎動物中目前共發(fā)現了4種Notch蛋白的同源體：Notchl、Notch2、Notch3和Notch4。Notch具有多種配體，哺乳動物中有Delta1、Delta-like3(Dll3)、Delta-like4(Dll4)、Jaggedl、Jagged2。在血管系統中，Notch1受體及Dll4主要表達在動脈內皮細胞上。有研究證明，當VEGF信號途徑被阻斷后，小鼠血管內皮細胞中Dll4的表達減少，從而使血管分支發(fā)育過程受阻〔12〕。

本研究前期研究發(fā)現腦泰方可促進缺血側腦組織VEGF的表達，但其是否能進一步上調Notch信號通路的表達，尚不清楚。本實驗結果顯示，提示腦泰方確有促進腦缺血周邊區(qū)VEGF-Notch信號通路表達的作用。

4 參考文獻

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3陳 懿,王國佐,葛金文.腦泰方提取物對局灶性腦缺血大鼠血管內皮細胞生長因子表達的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2009；24(2):205-7.

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11Ehebauer M,Hayward P,Arias AM.Notch a universal arbiter of cell fate decisions〔J〕.Science,2006,314(5804): 1414-5.

12Suchting S,Freitas C,Noble F,etal.The Notch ligand Delta-like 4 negatively regulates endothelial tip cell formation and vessel branching〔J〕.Proc Natl Acad Sci,2007；104(9): 3225-30.