李秀娟 曾 超 丁家望 吳 輝 李 莉 李 松 李穩(wěn)慧 姜玉蓉 楊 俊

(宜昌市中心人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443003)

鉀通道(kr)對心肌細(xì)胞的電生理穩(wěn)定性調(diào)控起著非常重要的作用〔1，2〕。人類ether--go-go相關(guān)基因HERG基因編碼心臟快速延遲整流鉀電流(Ikr)，Ikr是心肌細(xì)胞動(dòng)作電位3期快速復(fù)極的主要電流，在心臟動(dòng)作電位復(fù)極化過程中發(fā)揮重要作用。HERG及其調(diào)節(jié)亞基KCNE2基因突變可引起LQTs 綜合征〔3，4〕。心肌梗死(MI)后心室肌膜多種kr基因表達(dá)的的變化已成為近年研究熱點(diǎn)，但是關(guān)于MI后krHERG基因表達(dá)變化的研究很少，尤其是對大型動(dòng)物如豬的研究尚屬少見。本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR 方法觀察MI后左心室不同部位快速延遲整流鉀通道Kr基因HERG及其調(diào)節(jié)亞基KCNE2基因的mRNA表達(dá)改變及其意義，旨在探討急性心肌梗死(AMI)后早期室性心律失常發(fā)生的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級小型豬，體重10～15 kg(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物中心提供)，雌雄不限。術(shù)前常規(guī)檢查心電圖,心電圖異常者剔除，隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組(MI組)，共16只動(dòng)物。

1.2MI動(dòng)物模型的建立 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)前均禁食、禁飲12 h。術(shù)前稱重,予以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，在口腔明視下行氣管插管,以呼吸機(jī)機(jī)械通氣,潮氣量10～15 ml/kg，給氧3～5 L/min，頻率20～25次/min。常規(guī)消毒鋪巾，于胸骨正中打開胸腔,縱行切開心包膜,充分暴露心臟,并將心包膜縫合于胸壁呈吊籃狀。仔細(xì)分離冠狀動(dòng)脈,于冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)遠(yuǎn)端1/3～1/2處穿入4號縫合線,AMI組結(jié)扎2 h,再松解4 h,建立AMI模型,其成功標(biāo)志為:心電圖ST段弓背向上抬高,直視下可見被結(jié)扎血管供血區(qū)心肌變?yōu)樯n白色。假手術(shù)組也重復(fù)上述步驟,但冠狀動(dòng)脈下只穿線,不結(jié)扎。逐層縫合心包、胸壁，并放置引流管。術(shù)后精心喂養(yǎng)動(dòng)物至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。取結(jié)扎后存活的豬,分入MI組,建立假手術(shù)組,所有豬均接受相同的飼養(yǎng)條件。

1.3標(biāo)本的采集與保存 兩組均于術(shù)后24 h,用3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，迅速取出心臟置于4℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗除去血液，MI組取左心室梗死區(qū),梗死邊緣區(qū),非梗死區(qū)心肌組織各300 mg,同樣留取SH組左心室對應(yīng)部位心肌組織各300 mg,立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4心肌總RNA的提取和KCNH2和KCNE2 mRNA檢測 取50～100 mg豬心肌,應(yīng)用TRIZOL勻漿，提取組織總RNA，紫外光檢測樣品吸光度，A260/A280為1.95-2.10。應(yīng)用RT-PCR法(通用RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程有限公司)檢測mRNA的表達(dá),50℃ 30 min,94℃預(yù)變性2 min,PCR擴(kuò)增29個(gè)循環(huán)(94℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸4 min)后，1.5%瓊脂糖電泳分析PCR產(chǎn)物,應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄結(jié)果,用光密度掃描計(jì)算KCNH2電泳條帶灰度積分/β-actin電泳條帶灰度積分和KCNE2電泳條帶灰度積分/β-actin電泳條帶灰度積分，進(jìn)行半定量分析。各目的基因引物及β-actin引物序列、片段長度、退火溫度見表1。

表1 目標(biāo)基因與內(nèi)參基因引物序列及PCR反應(yīng)條件

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1動(dòng)物存活情況 MI組中9只豬存活6只,另外3只于術(shù)中發(fā)生室顫，經(jīng)心內(nèi)除顫無效死亡;假手術(shù)組中7只豬，1只因麻醉意外死亡,其余6只存活。

2.2豬心肌KCNH2和KCNE2基因mRNA表達(dá)的變化 假手術(shù)組KCNH2和KCNE2 mRNA的表達(dá)在梗死對應(yīng)區(qū)、梗死邊緣對應(yīng)區(qū)、非梗死對應(yīng)區(qū)之間無明顯差異(P>0.05)(見圖1、圖2)。MI 組KCNH2 mRNA 表達(dá)在梗死區(qū)較假手術(shù)組下調(diào)(P<0.05)；在梗死邊緣區(qū)較假手術(shù)組下調(diào)(P<0.05)；在非梗死區(qū)較假手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)。同時(shí)，KCNH2 mRNA 表達(dá)在梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)無明顯差異(P>0.05)，但較非梗死區(qū)下調(diào)(P<0.05)(見表2及圖1)。MI 組KCNE2 mRNA 表達(dá)在梗死區(qū)較假手術(shù)組降低(P<0.05)，而梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)較假手術(shù)組無明顯差異(P>0.05)。同時(shí)KCNE2 mRNA 表達(dá)在梗死區(qū)較梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)下調(diào)(P<0.05)，但梗死邊緣區(qū)和非梗死區(qū)之間的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)(見表2及圖2)。

表2 兩組不同部位KCNH2、KCNE2基因mRNA的表達(dá)±s)

1：MI組梗死區(qū)；2：MI組梗死邊緣區(qū)；3：MI組非梗死區(qū)；4：假手術(shù)組梗死對應(yīng)區(qū)；5：假手術(shù)組梗死邊緣對應(yīng)區(qū)；6：假手術(shù)組非梗死對應(yīng)區(qū)；下圖同

圖2 兩組不同部位KCNE2 RT-PCR電泳圖

3 討 論

近年來，人體遺傳分子學(xué)和生物學(xué)對先天性Q-T間期延長綜合征的研究，已突破性地揭示出心肌細(xì)胞有關(guān)離子通道基因表達(dá)的缺陷與心肌節(jié)律紊亂之間的關(guān)系，表明通道基因表達(dá)的異常是心律失常產(chǎn)生的機(jī)制之一〔5〕。kr在心肌細(xì)胞的電生理穩(wěn)定性調(diào)控中起著非常重要的作用。IKr是HERG(KCNH2)和KCNE2(MiRP1)表達(dá)的兩種蛋白質(zhì)共同形成功能性kr，KCNH2本身單獨(dú)可產(chǎn)生一種小的快速激活外向Ikr，KCNE2本身并不能產(chǎn)生任何離子電流，但它的存在主要影響通道的門控性和藥理學(xué)性質(zhì)。HERG及其調(diào)節(jié)亞基KCNE2基因突變可引起LQTs 綜合征。但在MI后HERG及其調(diào)節(jié)亞基KCNE2基因的表達(dá)有何改變，這些改變在心律失常中所起的確切作用尚不是很清楚。Pinto等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)MI后24 h犬的浦肯野纖維細(xì)胞上對E-4031敏感的電流增加，但是這種電流在正電位時(shí)缺乏內(nèi)向整流特性，所以說這種電流也并非是真正意義上的Ikr。Jiang等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)MI后2 d犬心室肌細(xì)胞的延遲整流Ikr的幅度減低及其動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變，Ikr激活和Iks失活加速，他們認(rèn)為這些變化歸因于有功能的相應(yīng)通道減少和/或通道亞單位成分的改變。Huang等〔8〕在大鼠MI模型研究中發(fā)現(xiàn)Ikr密度呈時(shí)間依賴性降低，動(dòng)作電位時(shí)程延長，認(rèn)為這些變化是MI后心臟早期致心律失常的原因。由此可見，MI后Ikr電流的電生理特性發(fā)生了改變，這可能是MI后易發(fā)心律失常的機(jī)制之一。

本研究KCNH2mRNA變化可能是MI后Ikr電流電生理特性發(fā)生改變的分子基礎(chǔ)。KCNH2基因mRNA的表達(dá)水平下調(diào)，可以造成有功能的快速延遲整流kr的數(shù)目減少，有助于Ikr電流的減小，可能是心肌細(xì)胞在恢復(fù)期的一種代償性保護(hù)性反應(yīng)，使膜Ikr變小，鉀離子外流減少，促進(jìn)急性缺血所造成的細(xì)胞內(nèi)外K+平衡失調(diào)的恢復(fù)。但是Ikr電流的減小，可使心室肌細(xì)胞APD延長，心肌細(xì)胞電生理特性改變，易于形成觸發(fā)活動(dòng)，產(chǎn)生心律失常。同時(shí)KCNE2基因mRNA表達(dá)水平的下調(diào)，使Ikr在整體行為，對細(xì)胞外K+及抗心律失常藥物的敏感性和通道的失活速率等方面發(fā)生改變，增加了電流的不穩(wěn)定性和發(fā)生心律失常的易感性。再者由于，KCNH2和KCNE2 mRNA的表達(dá)在梗死區(qū)、梗死邊緣區(qū)、非梗死區(qū)之間產(chǎn)生了明顯的差異，使空間異質(zhì)性增大，可導(dǎo)致復(fù)極不均一，復(fù)極離散度增大，易于形成折返發(fā)生心律失常。

因此，kr基因KCNH2和KCNE2 mRNA表達(dá)的下調(diào)和在不同部位改變的不均一可能在電生理不穩(wěn)定的維持和(或)惡化方面起一定的作用，但這種變化的確切意義和KCNH2和KCNE2基因兩者之間的相互作用還有待深入研究。

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