黃 彥 梁月屏 廖壯文 呂浩然 謝楚海

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，廣東 廣州 510260)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨的變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病〔1〕。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過度凋亡是OA發(fā)病的重要病理機(jī)制，而軟骨細(xì)胞的凋亡與線粒體關(guān)系密切，線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)是線粒體轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的關(guān)鍵激活子，與細(xì)胞凋亡過程相逆〔2〕。本研究分析膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患者、正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的線粒體DNA特征和TFAM表達(dá)的差異情況，以期闡明TFAM與OA發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1病例資料 選擇我院2011年10月至2012年10月的膝關(guān)節(jié)OA患者20例，入選OA組，同時(shí)設(shè)立因關(guān)節(jié)矯形等手術(shù)剩余的正常關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞20例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)制定的OA診治指南(2007年版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕。納入標(biāo)準(zhǔn)：①女性患者，絕經(jīng)1 年以上, 年齡55～65歲; ②符合上述的診斷標(biāo)準(zhǔn)； ③能夠收集到較為齊全的相關(guān)資料者并簽署知情同意書；④研究前患者均簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性膝骨關(guān)節(jié)炎患者；②6個(gè)月內(nèi)服用過影響骨代謝藥物的患者；③合并嚴(yán)重心、肝、腎以及其他系統(tǒng)疾病者,精神病及腫瘤患者；④不同意和配合進(jìn)行研究的患者。

1.2收集樣本和建立軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系

1.2.1關(guān)節(jié)軟骨的收集 取膝OA關(guān)節(jié)置換手術(shù)中取下關(guān)節(jié)軟骨。取下的軟骨組織置于含青霉素鈉/鏈霉素雙抗PBS液的無菌培養(yǎng)皿中，漂洗去除血細(xì)胞和關(guān)節(jié)滑液，清除滑膜組織。最后在含雙抗液的PBS液的無菌培養(yǎng)皿中用眼科剪將軟骨組織剪成1～3 mm大小的組織碎塊，注意使標(biāo)本保持濕潤(rùn)狀態(tài)。

1.2.2軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 無菌條件下取得標(biāo)本后立即置入盛有PBS的無菌培養(yǎng)皿中，無菌生物柜中取材術(shù)中切除的關(guān)節(jié)全層軟骨片(去除周圍軟組織)，無菌手術(shù)刀片切塊，剪碎，加入PBS液沖洗，將軟骨移入離心管中，加入Ⅱ型膠原酶，37℃培養(yǎng)箱中消化，其中2 h后每隔20 min晃動(dòng)離心管一次，至懸液變混濁確定為軟骨塊基本被消化。之后離心，棄上清液。加入完全培養(yǎng)基，充分吹打混勻后可獲得含有軟骨細(xì)胞的懸液。倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞培養(yǎng)各個(gè)時(shí)期的細(xì)胞形態(tài)，大小，分布。

1.2.3MTT比色法測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩種軟骨細(xì)胞，接種于96孔板，分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h、120 h后，加入20 μl MTT孵育4 h后，再加入100 μl DMSO溶解形成的甲瓚晶體，振搖10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用PI/Annexin V法，參照BD公司凋亡檢測(cè)試劑盒的說明書操作，將待檢測(cè)的兩種軟骨細(xì)胞在染色液中(10 ml PI, 1 ml Annexin V-FITC, 10 ml上樣緩沖液和79 ml H2O)室溫孵育15 min后，應(yīng)用用流式細(xì)胞儀在488 nm波長(zhǎng)氬離子激光下以Elite軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.3線粒體DNA特征與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達(dá)

1.3.1PCR引物及TaqMan探針 本實(shí)驗(yàn)中所有引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成、標(biāo)記。應(yīng)用熒光檢測(cè)物質(zhì)有報(bào)告基因FAM 和熄滅基因TAMRA。mtDNA D-loop HV1(Hipervariable region 1, HV1)上游引物5′-TTGCACGGTACCATAAATACTTGAC-3′，下游引物5′-GAGTTGCAGTTGATGTGTGATAGTTG-3′，TaqMan探針5′-CTCCCCATGCTTACAAGCAAGTACAGCAAT-3′，片段長(zhǎng)度128 bp。核β-globin基因上游引物5′-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3′，下游引物 5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，TaqMan探針5′-CTCCTGAG GAGA AGTCTGCT-3′，片段長(zhǎng)度110 bp。TFAM上游引物5′-GGAATGTGGAGCGTGCTAAAA-3′，下游引物5′-TGCTGGAAAAACACTTCGGAATA-3′，片段長(zhǎng)度118 bp。β-actin上游引物5′-TTCGAGCAAGAGATGGCCA-3′，下游引物 5′-TACATGGTGGTGCCGCC-3′，片段長(zhǎng)度270 bp。

1.3.2細(xì)胞線粒體DNA的提取 加RNase(200 μg/ml)于37℃、2～4 h消化RNA。之后，用酚、酚氯仿、異戊醇(體積比為25∶24∶1) DNA以去除蛋白質(zhì)、脂類等其他物質(zhì)。純化后的線粒體DNA量較少，線粒體DNA溶液加入0．6倍體積異丙醇或沉淀緩沖液，置于-20℃下放置30 min，進(jìn)行離心即得純凈的線粒體DNA。

1.3.3線粒體DNA拷貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 以線粒體DNA HV1和核單拷貝基因β-globin分別作為線粒體和核DNA拷貝數(shù)的標(biāo)記。設(shè)計(jì)HV1和β-globin基因的引物及探針，對(duì)該基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)之上，分別對(duì)待測(cè)樣本線粒體HV1和β-globin基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。線粒體DNA的拷貝數(shù)計(jì)算公式：相對(duì)拷貝數(shù)/二倍體核基因組=2×HV1/β-globin。

1.3.4線粒體轉(zhuǎn)錄因子A表達(dá)的測(cè)定 RNA抽提及逆轉(zhuǎn)錄cDNA：按照RNA提取試劑盒說明書提取組織RNA。置于紫外分光光度計(jì)上波長(zhǎng)為260 nm和280 nm處測(cè)量吸光值，計(jì)算兩者的比值，選取比值在1.7～2.0者用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA合成嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，合成的cDNA儲(chǔ)存在-20℃用于PCR反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)：加入上下游引物各，在7500 Real Time PCR儀監(jiān)測(cè)TFAM的表達(dá)差異。產(chǎn)物鑒定：取RT-PCR產(chǎn)物加入buffer，經(jīng)電泳后，溴乙錠染色。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS16.0軟件行方差分析及χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1倒置顯微鏡觀察 分離原代軟骨細(xì)胞呈球形，大小均一。正常組原代軟骨細(xì)胞呈圓形或橢圓形，貼壁較快，6 d后長(zhǎng)滿瓶壁，傳代后增殖加快，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞由橢圓形變?yōu)樗笮渭?xì)胞。而OA組原代細(xì)胞貼壁晚，單層集落樣，細(xì)胞形態(tài)多不規(guī)則，傳代后細(xì)胞以梭形為主，貼壁緩慢，4 d左右長(zhǎng)滿瓶壁。

2.2MTT試驗(yàn) 正常組增殖在24、48、72、96、120 h均較OA組明顯旺盛(P<0.01)，而OA細(xì)胞組增殖較慢，到72 h后趨向平臺(tái)期。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)各組MTT試驗(yàn)結(jié)果圖±s)

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 OA組的凋亡率高于正常細(xì)胞組(P<0.01)，正常細(xì)胞凋亡率為1.65%，OA細(xì)胞凋亡率為7.11 %。2 μg/L IL-1β作用72 h后，正常細(xì)胞凋亡率為13.79%，OA細(xì)胞凋亡率為35.13 %。2 μg/L濃度的IL-1β對(duì)OA軟骨細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)強(qiáng)于正常組(P<0.01)。

2.4線粒體DNA拷貝數(shù)和TFMA mRNA表達(dá)量的變化 HV1和β-globin基因定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0. 996和0. 998，斜率分別為-3.148和-3.369。OA組線粒體DNA的平均拷貝數(shù)為(389±117)，而正常細(xì)胞為(756±185)，前者顯著低于后者(P<0.01)。

2.5TFMA mRNA表達(dá)量的變化及與線粒體DNA拷貝數(shù)的關(guān)系 定量RT-PCR結(jié)果顯示，OA組TFMA mRNA的表達(dá)量(TFMA/β-actin)為0.556±0.021，而正常細(xì)胞表達(dá)量為1.053±0.024，前者低于后者(P<0.05)。見圖1。表達(dá)量和線粒體DNA拷貝數(shù)之間有相關(guān)性(r=0.924，P<0.01)；在OA組中，線粒體DNA拷貝數(shù)和TFMA mRNA的表達(dá)水平也有相關(guān)性(r=0.906，P<0.05)。

圖1 各組TFMA mRNA表達(dá)

3 討 論

軟骨細(xì)胞、蛋白多糖和Ⅱ型膠原相互作用，共同維持軟骨的生理性狀，其中任何改變都可以引起軟骨的退變〔4〕。大量研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞凋亡的增加是OA病理改變的重要特征〔5〕，Johnson等〔6〕研究證實(shí)，無論是活體還是體外培養(yǎng)，OA軟骨中存在過度的軟骨細(xì)胞凋亡。Leong等〔7〕認(rèn)為相比正常的軟骨細(xì)胞，OA的軟骨細(xì)胞所分泌的蛋白質(zhì)發(fā)生改變，同時(shí)合成代謝活動(dòng)減少、炎性細(xì)胞因子的增加和基質(zhì)降解酶活躍，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損傷。Musumeci等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，OA患者不僅軟骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)改變，較正常軟骨細(xì)胞凋亡的增加，而且基質(zhì)鈣化和蛋白多糖減少。因此，在本研究選擇軟骨細(xì)胞作為研究OA的作用點(diǎn)，體外培養(yǎng)觀察表明原代正常組細(xì)胞附壁生長(zhǎng)和增殖活性良好，具有較好的軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性，而OA組軟骨細(xì)胞的貼壁和增殖較慢，傳代久后生物學(xué)特性基本消失，凋亡明顯增多，對(duì)相同濃度IL-1β的誘導(dǎo)反應(yīng)敏感，提示分離的原代OA軟骨細(xì)胞符合軟骨細(xì)胞退變，為其研究提供了較好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

Musumeci等〔9〕的研究認(rèn)為，線粒體的功能障礙是破壞了軟骨細(xì)胞在關(guān)節(jié)內(nèi)微環(huán)境，從而導(dǎo)致了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生〔10〕。OA的軟骨細(xì)胞線粒體功能障礙可能來自體細(xì)胞中的線粒體DNA突變或炎癥介質(zhì)的直接影響，使軟骨基質(zhì)鈣化和軟骨細(xì)胞凋亡的增加。線粒體的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程需要核編碼的一些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控，在哺乳動(dòng)物中起主要調(diào)節(jié)作用的因子是TFAM〔11〕。TFAM是由596 bp核苷酸編碼的25 kD蛋白，具有兩個(gè)短串聯(lián)的高親和力的高遷移率族蛋白(HMG)盒域，在結(jié)構(gòu)上包含一個(gè)N端頭結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)HMG box結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C末端尾結(jié)構(gòu)， 兩個(gè)HMG box之間還存在一個(gè)由27個(gè)氨基酸殘基組成的短連接區(qū)域。Rebelo等〔12〕的研究認(rèn)為，TFAM與線粒體DNA在線粒體中結(jié)合成復(fù)合體，從而保持線粒體DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OA軟骨細(xì)胞TFMA mRNA的表達(dá)量低于正常軟骨細(xì)胞，說明OA軟骨細(xì)胞中線粒體DNA拷貝數(shù)下降，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的主要調(diào)節(jié)因子TFMA的表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)。Nakanishi等〔13〕研究后認(rèn)為TFAM可以改善線粒體DNA的損傷和減少，由此產(chǎn)生的氧化還原調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)；Woo等〔14〕研究了敲除線粒體TFAM基因的小鼠，發(fā)現(xiàn)其線粒體DNA出現(xiàn)缺失，同時(shí)出現(xiàn)線粒體的氧化損傷。

在軟骨細(xì)胞中線粒體轉(zhuǎn)錄因子A在線粒體DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、結(jié)構(gòu)的維持和損傷修復(fù)及細(xì)胞凋亡中均起著重要作用。線粒體DNA自身遺傳結(jié)構(gòu)改變和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A等因素共同作用是導(dǎo)致OA軟骨細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)改變的原因。

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