張明惠 杜新平 姜忠敏 李艷霞 盛 鳳 劉曉智

(天津市第五中心醫(yī)院心內(nèi)科，天津 300450)

干細(xì)胞憑借其多組織分化潛能，成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)界多學(xué)科研究熱點(diǎn)〔1～3〕。各學(xué)科在積極嘗試將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為各自所需的組織與器官時(shí)，由于常帶有明確的目的性和方向性，誘導(dǎo)方法的選擇和實(shí)施差別較大，較難比較干細(xì)胞在同一干預(yù)條件下的橫向分化潛能和特征〔4〕。最近有學(xué)者報(bào)道將干細(xì)胞移植到特定物理密度的材料表面時(shí)，干細(xì)胞有順材質(zhì)硬度分化的特性〔5〕?；诖耍狙芯拷柚腿埸c(diǎn)瓊脂設(shè)計(jì)出一種低密度介質(zhì)，研究臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在該介質(zhì)中的生長狀態(tài)和組織分化特點(diǎn)，嘗試?yán)梦锢砀深A(yù)手段實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞向心肌組織的橫向分化，為未來心肌組織工程研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試劑和動(dòng)物 胎牛血清(杭州四季青產(chǎn)品)，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，低熔點(diǎn)瓊脂糖(北京中杉公司)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記流式抗體CD29、CD31、CD44、CD45和CD105(英國Serotec公司)，抗小鼠CD34抗體(美國Santa Cruz公司)，抗小鼠心肌特異性基因肌球蛋白重鏈α(α-MHC)和抗小鼠心臟特異性肌鈣蛋白T(cTnT)抗體(美國Santa Cruz公司)；PCR引物由北京賽百勝公司合成，RT-PCR試劑盒購自美國Qiagen公司。清潔級(jí)1周齡雄性SD大鼠5只用于BMSCs原代培養(yǎng)。動(dòng)物由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于天津市血液病研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離、培養(yǎng) 雄性SD大鼠拉頸處死后，置于75%酒精中浸泡消毒5 min。無菌條件下分離雙側(cè)股骨和脛骨，剪開長骨兩端骨皮質(zhì)，露出骨髓腔，用含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，收集細(xì)胞懸液，接種到10 cm塑料培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天半量換液，之后每隔3 d全量換液，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長情況。至10～14 d單層貼壁細(xì)胞接近90%匯合時(shí)，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2傳代。以后隨細(xì)胞擴(kuò)增均于80%～90%匯合時(shí)按1∶2持續(xù)體外傳代培養(yǎng)。

1.3BMSCs的表面標(biāo)記蛋白鑒定 體外培養(yǎng)細(xì)胞至第4代，接近90%匯合時(shí)，PBS洗滌2次，0.25%胰蛋白酶消化；收集細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min，棄上清后用PBS重懸細(xì)胞沉淀；應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取約1×106個(gè)細(xì)胞懸于100 μl PBS中；分別加入適量異硫氰酸標(biāo)記CD29、CD31、CD44、CD45、CD105抗體避光染色30 min，CD34檢測采用間接熒光標(biāo)記法，細(xì)胞與CD34抗體反應(yīng)30 min后，需再與異硫氰酸標(biāo)記二抗避光反應(yīng)30 min。最后用1%多聚甲醛600 μl重懸，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.4凝膠介質(zhì)的配制 預(yù)先配制含10%胎牛血清的DMEM，取1.28 g低熔點(diǎn)瓊脂糖加入10 ml上述培養(yǎng)基中，充分混勻至溶解，以后依次二等分稀釋配制成6.4%、3.2%、1.6%、0.8%、0.4%和0.2% 6種物理密度基質(zhì)，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂们凹訙厝诨烈簯B(tài)再冷卻至37℃～39℃后，與BMSCs混合培養(yǎng)。

1.5不同密度凝膠介質(zhì)中的細(xì)胞培養(yǎng) 在48孔板各孔底預(yù)鋪置0.5 ml含0.9%瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內(nèi)過夜凝固；取第5代BMSCs單細(xì)胞懸液1×103個(gè)細(xì)胞分別與上述6種物理密度基質(zhì)培養(yǎng)液各0.25 ml混勻，迅速加入48孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜凝固；24 h后每孔各加入50 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基。7 d后將6種含細(xì)胞的凝膠介質(zhì)制作6 μm薄層切片，低溫冰箱儲(chǔ)存待測。

1.6RT-PCR方法檢測細(xì)胞分化標(biāo)記基因的mRNA水平 提取6種密度凝膠介質(zhì)中培養(yǎng)的細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)。內(nèi)參照物β-actin上游引物：5′-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3′，下游引物：5′-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3′，擴(kuò)增長度為 517 bp；α-MHC上游引物：5′-AGCCTCTGCTACTCCTCTTCCTG-3′，下游引物：5′-CCTTTATGGTACCGTTTCC-3′，擴(kuò)增長度為345 bp；cTnT上游引物：5′-ATCCTCGGACCTGCACCGC-3′，下游引物：5′-CCTACCTAGGCCTGCC-3′，擴(kuò)增長度為408 bp。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，45個(gè)循環(huán)，循環(huán)內(nèi)94℃ 30 s、60℃ 45 s、72℃ 30 s。

1.7細(xì)胞免疫熒光方法檢測細(xì)胞分化標(biāo)記蛋白的表達(dá) 切片放置4℃冰箱30 min后，以4%多聚甲醛固定，Triton X-100處理后，磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡，山羊血清封閉30 min；小心吸去血清，滴加適當(dāng)稀釋度的抗體工作液(cTnT，1∶500；α-MHC，1∶1 000)，濕盒中4℃過夜；加入FITC或TRATIC熒光標(biāo)記二抗，hoechst33258復(fù)染，PBS和去離子水漂洗后，封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs鑒定 對(duì)第4代BMSCs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定，結(jié)果為CD29(99.58%)、CD44(99.16%)、CD105(99.23%)陽性，CD31(2.33%)、CD34(3.13%)、CD45(4.14%)陰性。其中CD29、CD44、CD105是BMSCs特異表達(dá)陽性標(biāo)記物，CD31是內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，CD34和CD45是造血干細(xì)胞標(biāo)記物。通過多指標(biāo)聯(lián)合檢測證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為BMSCs，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2RT-PCR結(jié)果 cTnT和α-MHC mRNA表達(dá)水平隨介質(zhì)密度變化而變化。隨著介質(zhì)密度增高，cTnT和α-MHC mRNA表達(dá)水平均呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，其中cTnT mRNA表達(dá)峰值出現(xiàn)在物理密度為1.6%的培養(yǎng)基質(zhì)中，而α-MHC的峰值出現(xiàn)在物理密度為3.2%的培養(yǎng)基質(zhì)中。見圖1、圖2。

圖1 PCR方法檢測cTnT和α-MHC的mRNA表達(dá)

圖2 cTnT和α-MHC的mRNA表達(dá)曲線圖

2.3細(xì)胞免疫熒光結(jié)果 BMSCs在不同密度基質(zhì)中培養(yǎng)時(shí)可表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記蛋白，其中綠色熒光為FITC標(biāo)記的cTnT陽性信號(hào)，紅色熒光為TRATIC標(biāo)記的α-MHC陽性信號(hào)，可見BMSCs在不同密度基質(zhì)中培養(yǎng)時(shí)表達(dá)cTnT和α-MHC的總體趨勢與RT-PCR結(jié)果一致。見圖3。

圖3 免疫熒光顯示BMSCs在不同密度基質(zhì)中培養(yǎng)時(shí)表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記蛋白(×200)

3 討 論

心肌梗死是心血管系統(tǒng)的常見病。由于成熟的心肌細(xì)胞缺乏再生能力，心肌梗死發(fā)生后，梗死區(qū)心肌只能通過纖維組織增生，由無收縮功能的瘢痕組織代替，最終導(dǎo)致心功能下降和心力衰竭〔6〕。隨著人類和動(dòng)物胚胎干細(xì)胞成功建系及其體外向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化技術(shù)日漸成熟，干細(xì)胞為治療心血管疾病提供了新的種子細(xì)胞來源和思路〔1～3〕。

最近有研究報(bào)道，將BMSCs自然貼附于羥基磷灰石膠原蛋白復(fù)合支架表面時(shí)干細(xì)胞表達(dá)的骨組織標(biāo)記蛋白明顯增加〔5〕。我們推測干細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)的物理密度可能存在誘導(dǎo)干細(xì)胞向特定組織分化的潛能。如果該理論正確，將可實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞在同種介質(zhì)下向多組織細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，增加可調(diào)控性。本研究首次以一種物理性質(zhì)獨(dú)特的超低膠凝溫度的瓊脂糖為介質(zhì)，配制成不同物理密度的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)，對(duì)BMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化研究，觀察成體干細(xì)胞在物理密度介質(zhì)中的順材質(zhì)分化特性。超低膠凝溫度的瓊脂糖是一種獨(dú)特的“軟瓊脂糖”，具有超低的膠凝及熔化溫度，適用于雜交瘤克隆及制造軟的高純度凝膠。實(shí)驗(yàn)室中最常被應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、雜交瘤克隆、封裝/包埋細(xì)胞等〔7〕。在實(shí)體組織中，腦組織彈性模量介于0.1～1 kPa，平滑肌組織彈性模量介于8～17 kPa，筋膜組織彈性模量介于25～40 kPa，骨組織彈性模量介于75～100 kPa〔8〕。利用超低膠凝溫度的瓊脂糖與含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基按不同比例混合配制成具有不同彈性模量的培養(yǎng)基質(zhì)，模擬腦組織-平滑肌組織-筋膜組織-軟骨組織-骨組織介質(zhì)，研究干細(xì)胞在上述密度基質(zhì)中的細(xì)胞分化特征。

根據(jù)超低溫膠凝瓊脂糖特征，1.6%瓊脂糖凝膠的凝膠溫度為8℃～20℃，彈性模量約12 kPa；3.2%瓊脂糖凝膠的凝膠溫度為10℃～23℃，彈性模量約18 kPa〔8〕。即當(dāng)BMSCs培養(yǎng)于1.6%～3.2%瓊脂糖凝膠時(shí)，介質(zhì)彈性模量介于12～18 kPa，符合平滑肌組織彈性模量(8～17 kPa)范圍，此時(shí)表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)記蛋白cTnT和α-MHC，但二者出現(xiàn)峰值的區(qū)間并不完全相同，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究?？傊?，本實(shí)驗(yàn)通過改變培養(yǎng)介質(zhì)的物理密度，實(shí)現(xiàn)了將BMSCs向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，為未來成體干細(xì)胞向不同組織誘導(dǎo)分化提供新的方式選擇。

4 參考文獻(xiàn)

1賀繼剛，沈振亞，滕小梅，等.小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞亞群在心肌梗死中抗凋亡能力的研究〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013；30(3)：556.

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3劉曉智，劉振林，姜忠敏，等.不同物理密度介質(zhì)誘導(dǎo)干細(xì)胞表達(dá)多種組織細(xì)胞標(biāo)記蛋白〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2012；29(2)：341.

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6魏增華，郝懷勇，賀敏敏，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合Janus激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子通路抑制劑治療大鼠腦缺血再灌注損傷〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2013；30(7)：1481-3.

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8Herrmann RG，Whitfeld PR，Bottomley W.Construction of a SalI/PstI restriction map of spinach chloroplast DNA using low-gelling-temperature-agarose electrophoresis〔J〕.Gene，1980；8(2)：179-91.