李 娜 曲曉波 葉豆丹 李 晶 律廣富 林 賀 楊 擎 常志達(dá) 張靖卓 李 斌 林 喆

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心藥理實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130117)

四妙勇安激發(fā)(SMYA)是治療熱毒性脫疽的經(jīng)驗(yàn)良方，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草四味藥組成，具有清熱解毒、滋陰活血、通絡(luò)功效。熱毒性脫疽是古時(shí)候的主要適應(yīng)證，和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的多種動(dòng)脈狹窄或閉塞而導(dǎo)致的趾(指)脫落壞死性疾病相似，包括血栓閉塞性脈管炎、動(dòng)脈硬化閉塞癥、糖尿病性壞疽等疾病〔1～3〕。本研究通過(guò)對(duì)SMYA對(duì)氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心)，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2藥物、試劑與儀器 SMYA醇提物，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室制備；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、內(nèi)皮素(ET)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOs)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒為美國(guó)BG公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司。

1.3方法

1.3.1分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞ECV304隨機(jī)分成三組：空白組，用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型組，H2O2損傷，濃度為1 mmol/L，損傷4 h；SMYA組：先用H2O2損傷4 h后，50%EtOH提取物100 μg/ml培養(yǎng)24 h。

1.3.2四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞活力 消化后的細(xì)胞，5×104個(gè)/ml，200 μl接種于96孔板，培養(yǎng)24 h完全貼壁，按1.3.1分組，模型組和SMYA組先用H2O2(1 mmol/L，4 h)處理，棄上清，模型組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，給藥組用SMYA醇提物處理24 h，每孔20 μl加入MTT，4 h后甩板，每孔加入150 μl二甲基亞礬(DMSO)使其顯色，顯色后振動(dòng)孵育10 min，使結(jié)晶溶解完全，酶標(biāo)儀490 nm測(cè)吸光度值(OD值)。

1.3.3SMYA醇提物對(duì)氧化損傷ECV304細(xì)胞周期的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次。將約1 ml，4℃70%乙醇緩緩貼壁加入離心管，固定細(xì)胞。上機(jī)前，1 500 r/min離心5 min，重新收集細(xì)胞，PBS洗2次。加入RNA酶和20 μl溴化碘(PI)，室溫避光染色20 min，用300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.4SMYA醇提物對(duì)氧化損傷ECV304細(xì)胞凋亡率的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，4℃PBS清洗兩次。先加500 μl Binding Buffer，然后分別將5 μl Annexin V-FITC和PI 10 μl加入，避光孵育10 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5ACE、ET、eNOs含量測(cè)定 按1.3.1方法培養(yǎng)細(xì)胞后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，10 000 r/min，離心10 min，取上清液，按試劑盒要求，檢測(cè)細(xì)胞上清液中ACE、ET、eNOs的含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SMYA醇提物對(duì)H2O2損傷ECV304細(xì)胞活力的影響 模型組細(xì)胞活力(0.76±0.07)明顯低于空白組(1.30±0.19)(P<0.01)，說(shuō)明模型建立成功；且SMYA組細(xì)胞活力(1.34±0.10)均高于模型組(P<0.01)。

2.2SMYA醇提物對(duì)H2O2損傷ECV304細(xì)胞凋亡的影響 結(jié)果顯示，空白組細(xì)胞凋亡率為9.5%，模型組為23.3%，而SMYA醇提物處理過(guò)的損傷后ECV304的凋亡率為13.2%，模型組細(xì)胞凋亡率最高，SMYA醇提物干預(yù)后細(xì)胞凋亡率明顯降低。

2.3SMYA醇提物對(duì)H2O2損傷ECV304細(xì)胞周期的影響 由檢測(cè)結(jié)果分析，模型組與空白組比較，G1期細(xì)胞比例增多(P<0.01)，進(jìn)入S和G2期的細(xì)胞百分比減少(P<0.05)，與模型組比較SMYA組，G1期細(xì)胞進(jìn)入S和G2期的細(xì)胞百分比增多，G1期細(xì)胞百分比顯著下降(P<0.05)，S期細(xì)胞百分比顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 SMYA醇提物對(duì)H2O2損傷的ECV304細(xì)胞周期的影響±s,n=6，%)

2.4SMYA醇提物對(duì)H2O2損傷ECV304細(xì)胞中ACE、ET、eNOs影響 模型組H2O2可使ACE和ET的含量明顯增高，eNOS活性降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，SMYA醇提物可抑制ACE的活性，并可顯著性降低ET含量(P<0.05)，升高eNOS活性(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 SMYA50%醇提物對(duì)H2O2氧化損傷ECV304分泌ACE、ET、eNOS的影響±s,n=6)

3 討 論

SMYA在古代是治療熱毒性脫疽的經(jīng)驗(yàn)良方，具有清熱解毒、滋陰養(yǎng)血、活血化瘀等功效，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多用于治療周圍血管性疾病，前期工作中，建立了血栓閉塞性脈管炎模型大鼠，觀察SMYA對(duì)其血脂、血液流變學(xué)及抗炎的作用，證明了SMYA對(duì)血栓閉塞性脈管炎大鼠的治療作用〔4,5〕。為進(jìn)一步探討其機(jī)制，從細(xì)胞水平進(jìn)行了研究。

血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)是覆蓋于血管內(nèi)膜表面的單層扁平或多角形的細(xì)胞，形成血管的內(nèi)壁，與平滑肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等共同構(gòu)成完整的血管壁〔6,7〕。VEC的功能和血管活性物質(zhì)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮素(ET)、一氧化氮(NO)和血管緊張素(ACE)Ⅱ等物質(zhì)有著密切的聯(lián)系。VEC受損在多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，例如血栓閉塞性脈管炎。缺氧條件下，可以使內(nèi)皮細(xì)胞功能明顯損傷，可探討血管功能變化與調(diào)控機(jī)制〔8～10〕。ACE催化血管緊張素(Ang)Ⅰ轉(zhuǎn)化為(Ang)Ⅱ，使緩激肽失活。AngⅡ可導(dǎo)致血壓上升，強(qiáng)烈的收縮外周小動(dòng)脈，促進(jìn)醛固酮的合成和分泌；重吸收鈉離子和水，增加血容量；AngⅡ是最強(qiáng)的升壓活性物質(zhì)。研究表明，SMYA 50%醇提物能夠明顯抑制過(guò)氧化氫損傷ECV 304分泌ACE，阻斷了腎素血管緊張素系統(tǒng)的進(jìn)一步發(fā)展。如吳旭等〔11〕認(rèn)為VEC、ACE在缺血缺氧時(shí)表達(dá)增多〔12,13〕。

ET和NO是一對(duì)相互拮抗的物質(zhì)，正常生理情況下，兩者相互作用，形成穩(wěn)定的血管內(nèi)皮調(diào)節(jié)系統(tǒng)，ET可增加NOS的活性，從而促進(jìn)NO的生成，而NO又可以反過(guò)來(lái)拮抗ET的作用。兩者之間的這種拮抗作用在維持血管正常收縮與舒張功能和調(diào)節(jié)局部血流等方面起到重要的作用〔14〕。

G1期又稱為合成前期，處于這一期的細(xì)胞物質(zhì)代謝活躍，細(xì)胞體積大，為S期DNA復(fù)制作物質(zhì)和能量的準(zhǔn)備。S期是DNA合成期，合成組蛋白。G2期是DNA合成后期，是有絲分裂的準(zhǔn)備期，DNA合成終止。M期為細(xì)胞分裂期。G1期和S期階段細(xì)胞分布的多少，是評(píng)價(jià)細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞環(huán)境的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)表明，SMYA醇提物可明顯促進(jìn)H2O2損傷ECV304G1期細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)正常內(nèi)皮細(xì)胞、缺氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞及SMYA干預(yù)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞三種細(xì)胞的細(xì)胞周期，表明SMYA醇提物具有明顯降低氧化損傷細(xì)胞凋亡率的能力，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)建立了內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞周期與凋亡，以及內(nèi)皮細(xì)胞分泌ACE、ET和eNOS含量，證明了SMYA醇提物具有明顯的保護(hù)氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步的研究提供了依據(jù)。

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