王曉冰

(內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院，內(nèi)蒙古 牙克石 022150)

子宮內(nèi)膜癌是婦科臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，分子生物學(xué)研究認(rèn)為，信號傳導(dǎo)系統(tǒng)的缺陷和異?；罨瘜?dǎo)致腫瘤凋亡抑制和增殖異常活化是腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制〔1〕，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展成為眾多研究者關(guān)注的熱點，已有研究〔2〕表明正常的p53基因編碼53 kD的蛋白，在細(xì)胞周期中起重要的調(diào)節(jié)作用，對細(xì)胞癌變有抑制作用，當(dāng)該基因發(fā)生點突變，缺失和滅活時，即由野生型轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃?，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。突變型p53基因在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中有重要的意義〔3，4〕。本研究探討血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與突變型p53基因在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集我院2007年10月至2010年10月門診及住院處就診的原發(fā)性子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后標(biāo)本50例，病變組織浸泡于10%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋。年齡60～83〔平均(71.5±3.6)〕歲。平均孕次(2.93±1.20)次，平均產(chǎn)次(2.0±1.5)次。所有病例診斷經(jīng)病理證實。全部病例組織學(xué)分類和手術(shù)病理分期按照2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。手術(shù)病理分期：Ⅰ期～Ⅱ期33例，Ⅲ期以上17例；組織學(xué)分類：高分化(G1)19例，中分化(G2)18例，低分化(G3)13例。肌層浸潤深度>1/2者14例，≤1/2者36例。同時選取50例正常增生期子宮內(nèi)膜組織作對照，年齡60～85〔平均(70.8±4.2)〕歲。平均孕次(2.58±1.30)次，平均產(chǎn)次(2.2±1.6)次。兩組年齡、孕次、產(chǎn)次等一般資料比較無差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2試劑和儀器 鼠抗人p53單克隆抗體，兔抗人多克隆抗體VEGF,SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自Bioworld生物科技公司，抗體稀釋濃度均為1∶100。以PBS代替一抗作為空白對照。

1.3試驗方法 選取組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，采用SP法免疫組織化學(xué)染色法檢測。免疫組化步驟按SP試劑盒說明書操作。將標(biāo)本石蠟組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水洗、孵育(加過氧化氫)20 min，再一抗孵育90 min，進(jìn)行PBS液緩沖后在進(jìn)行二抗孵育60 min，再次進(jìn)行PBS液緩沖，加辣根過氧化酶復(fù)合物孵育60 min后DAB顯色，鏡下蘇木素染色、水洗、脫水、透明，中性樹膠封固而染色成片。

1.4判定標(biāo)準(zhǔn) 顯微鏡下觀察，p53陽性染色主要在腫瘤細(xì)胞核的棕色染色為準(zhǔn)，>10%為陽性；VEGF主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá),先用低倍鏡閱片，再用高倍鏡選取5個高倍視野，首先將染色強(qiáng)度打分:0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。染色深淺需與背景著色相對比。再將陽性細(xì)胞所占的百分比打分:0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞<10%，2分為陽性細(xì)胞11%～50%，3分為陽性細(xì)胞51%～80%，4分為陽性細(xì)胞≥81%。染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積>6分為高表達(dá)，<6分為低表達(dá)〔5〕。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1不同子宮內(nèi)膜癌組織突變型p53及VEGF蛋白的表達(dá) 突變型p53、VEGF蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織的表達(dá)陽性率均顯著高于正常子宮內(nèi)膜(χ2=8.682、6.703，P<0.01)。見表1。

2.2子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征與p53及VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性 子宮內(nèi)膜癌組織中p53表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級、臨床分期、肌層浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(χ2=5.028、6.657、5.502、11.293，P<0.05)；VEGF蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與臨床分期、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(χ2=4.566、4.098、9.305，P<0.05)；VEGF蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌肌層浸潤深度無明顯相關(guān)性(χ2=0.374，P>0.05)。見表2。

表1 不同子宮內(nèi)膜組織突變型p53及VEGF蛋白的表達(dá)(n,n=50)

表2 子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征與p53及VEGF蛋白表達(dá)的關(guān)系〔n(%)〕

2.3子宮內(nèi)膜癌P53及VEGF蛋白的表達(dá)相關(guān)性 Spearman等級相關(guān)分析顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中VEGF與p53蛋白的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.482，P<0.01)。

3 討 論

p53是腫瘤的克星。當(dāng)細(xì)胞核中的DNA受損時，p53或者阻止非正常細(xì)胞復(fù)制，直到DNA被修復(fù)，或者引導(dǎo)“細(xì)胞自殺”。大部分癌癥都是缺陷基因引起的，p53變異是常見的基因缺陷。p53基因與細(xì)胞的分化、凋亡、DNA修復(fù)密切相關(guān)，分為野生型(WTP53)和突變型兩種〔6〕。P53的突變和缺失，是許多腫瘤發(fā)生的重要原因之一。各種腫瘤均有各自的惡變階段，如結(jié)腸息肉癥、胃黏膜不典型增生、化生和萎縮性胃炎、慢性肝炎、肝硬化、乳腺增生、慢性鼻炎、慢性宮頸炎等，均為癌前病變。有癌前病變?nèi)巳夯寄[瘤的概率高于正常人群〔7〕。主要原因是由于炎癥的長期浸潤，病變部位的DNA受損細(xì)胞遠(yuǎn)多于正常部位，這增加對抑癌基因p53的要求。但炎癥也同樣會損傷p53基因，致其突變，造成癌前病變部位的p53表達(dá)反而更少。因此，增強(qiáng)野生型p53基因在細(xì)胞中的表達(dá)，是癌前病變患者防癌的重要手段〔8〕。抑癌基因p53 編碼核磷酸蛋白，具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、抑制細(xì)胞生長、誘導(dǎo)凋亡的作用。p53 基因突變后失去正常抑癌作用，可促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。在發(fā)生突變時，其半衰期延長，可通過免疫組化染色檢測到，呈細(xì)胞核表達(dá)〔9〕。本研究結(jié)果顯示組織學(xué)分級越高，p53 陽性表達(dá)率越高。突變型p53、VEGF蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織的表達(dá)陽性率均顯著高于正常子宮內(nèi)膜,提示p53 基因突變與細(xì)胞惡性程度上升有關(guān)，可能與腫瘤組織學(xué)分級、臨床分期、肌層浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。p53 的突變在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中具有重大意義，利用p53 對早期子宮內(nèi)膜癌的診斷及失去手術(shù)機(jī)會，對放、化療不敏感的晚期子宮內(nèi)膜癌治療有潛在價值。這應(yīng)是子宮內(nèi)膜癌診治研究的其中一個重要方向。腫瘤組織中新生血管形成是在腫瘤現(xiàn)有的血液供應(yīng)基礎(chǔ)上產(chǎn)生新的血管，這些新生血管可以為腫瘤細(xì)胞提供養(yǎng)分，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、生長、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，是腫瘤組織生長有別于其他正常組織的特征。

VEGF可在乳腺癌組織細(xì)胞中檢測到〔10〕，具有以下生物學(xué)功能：①促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖與遷徙，從而刺激新生血管生成；②增加血管通透性；③抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡發(fā)生；④抑制樹突狀細(xì)胞的成熟。新生血管生成是活體組織在已經(jīng)存在的微血管床上芽生出以新生毛細(xì)血管為主的血管系統(tǒng)過程，是腫瘤賴以生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。在沒有血管為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞就會很快凋亡，腫瘤大小一般也超不過2～3 mm3。新生血管不僅僅為腫瘤組織提供營養(yǎng)，而且還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供方式〔11〕。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長、增殖以及轉(zhuǎn)移和其他實體腫瘤細(xì)胞一樣，依賴于腫瘤血管形成，新生血管生成是腫瘤生長的必備條件〔12〕。本研究結(jié)果顯示VEGF蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織的表達(dá)陽性率均顯著高于正常子宮內(nèi)膜，VEGF蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)與臨床分期、組織學(xué)分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。VEGF 是調(diào)控血管生成的主要因子，主要是特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)有絲分裂，使新生血管形成，增加血管通透性，加快腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。有研究表明，VEGF 同腫瘤大小、TNM 分期、組織學(xué)分級、淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)關(guān)系〔13〕。VEGF 是受缺氧條件調(diào)控的血管生成調(diào)節(jié)因子，缺氧情況下腫瘤細(xì)胞的增殖會加速，腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中，缺氧狀態(tài)可以導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)及功能異常。VEGF作為正常機(jī)體組織中促進(jìn)血管生成的重要因子，在機(jī)體組織細(xì)胞受到損傷后具有促進(jìn)新生血管生成，加速受損組織細(xì)胞恢復(fù)，但在腫瘤組織中，由于正常生理平衡受到破壞，病理狀態(tài)下VEGF 對腫瘤中新生血管的生成同樣具有重要作用，貫穿于腫瘤生長、轉(zhuǎn)移過程的始終〔14〕。綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織中VEGF與p53蛋白的表達(dá)呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞組織分級特征與p53、VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性提示p53、VEGF可能成為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后因子，因此，聯(lián)合檢測p53、VEGF為評估子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)行為、分化程度和判斷預(yù)后提供依據(jù)，對指導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的早期診斷及治療有重要價值。

4 參考文獻(xiàn)

1Jemal A，Siegel R，Ward E，etal.Cancer statistica〔J〕.CA Cancer J Clin，2007；57(1)：43-66.

2周 琦，田桂蘭，肖 覺，等.子宮內(nèi)膜癌p53表達(dá)的臨床意義研究〔J〕.腫瘤防治雜志，2003；10(8)：825-7.

3張育軍，魏麗惠，王建六.腫瘤抑癌蛋白PTEN、P53在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)〔J〕.中國婦產(chǎn)科臨床，2001;2(4):230-2.

4魏志敏，姜天福，孫顯路，等.子宮內(nèi)膜樣腺癌p53、c-erbB2 CD44v6和雌孕激素受體聯(lián)合檢測的臨床意義〔J〕.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004；40(1)：42-3.

5Ioffeo B，Papadimitriou JC，Drachenberg CB.Correlation of proliferation indices，apoptosis，and related on-cogene expression(bcl-2 and c′erbIB2)and p53 in proliferative，hyperplastic， and malignant endometrium〔J〕. Hum Pathol，1998；29(10)：1150-9.

6許 斌,張春蕾,韓 冬.子宮內(nèi)膜癌PTEN蛋白及P53蛋白的異常表達(dá)〔J〕.中國體視學(xué)與圖像分析,2007；12(1):16.

7古吉敏,華 平,李天永.PTEN蛋白及P53蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的異常表達(dá)〔J〕.四川醫(yī)學(xué),2008；29(11):1527.

8仰 晨,吳元赭,李桂梅.PTEN和P53蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床意義〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志,2007；12(7):505.

9耿 蕾，崔竹梅，李玉軍，等.HIF 1a、VEGF及IGF-I蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其意義〔J〕.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2006；21(3)：207-12.

10Lee JS，Kim HS，Park JT，etal.Expression of vascular endothelial growth factor in the progression of cervical neopla-sia and its relation to angiogenesis and p53 status〔J〕.Anal Quant Cytol Histol，2003；25(6)：303-11.

11Granblatt MS,Benett WP,Hollstein M,etal.Mutation in the p53 tumor suppressor gene;clues to cancer etology and molecular pathogenesis〔J〕. Cancer Res,1994；54(12):4855-78.

12Laderoute KR，Alarcon RM，Brody MD，etal.Opposing effects of hypoxia on expression of the angiogenic inhibitor thrombospondin 1 and the angiogenic inducer vascular endothelial growth factor〔J〕.Clin Cancer Res，2000;6(7):2941-50.

13Linderholm B，Hindh B，Tavelin B，etal.p53 and vascular-endothelial-growth factor(VEGF) expression predicts outcome in 833 patients with primary breast carcinoma〔J〕.Int J Cancer，2000；89(1)：51-62.

14Sawan A,Lason I,Veron M,etal.NDPK/nm23 expression in human breast cancer in relation to relapse,survival and other prognostic factor.An immunohistochemical study〔J〕.J Pathol，1994；172:72.