郭成永，梁朝輝，魏可欣，孫國柱，焦保華Δ，趙宗茂

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050011；2.保定市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北保定071000）

雷帕霉素對膠質(zhì)瘤患者瘤體解旋酶RECQ1表達的影響研究

郭成永1，梁朝輝1，魏可欣2，孫國柱1，焦保華1Δ，趙宗茂1

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北石家莊050011；2.保定市第一醫(yī)院神經(jīng)外科，河北保定071000）

目的探討雷帕霉素對腦膠質(zhì)瘤患者瘤體解旋酶RECQ1(Tumor helicase RECQ1）表達的影響。方法選取河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)外科收治的腦膠質(zhì)瘤患者50例，隨機分為2組，其中對照組25例，予常規(guī)手術(shù)治療；實驗組25例，先予以雷帕霉素膠囊，1mg，1次/天口服，連續(xù)服用14天，停藥后1周行手術(shù)治療。術(shù)中取膠質(zhì)瘤組織樣本，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR）技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測瘤體解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白質(zhì)表達。結(jié)果對照組患者膠質(zhì)瘤組織瘤體解旋酶RECQ1 mRNA表達較實驗組膠質(zhì)瘤組織明顯升高，對照組光密度值為(1.657±0.748），而實驗組光密度值為(1.059±0.894），統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）；所有組織中瘤體解旋酶RECQ1蛋白均有表達，但實驗組患者的膠質(zhì)瘤組織中的瘤體解旋酶RECQ1蛋白表達(0.952±0.021）明顯低于對照組(1.211±0.024），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。結(jié)論雷帕霉素膠囊能夠降低解旋酶RECQ1 mRNA表達，能夠抑制腦膠質(zhì)腫瘤細胞DNA的復(fù)制，有效殺滅癌細胞，控制腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，改善預(yù)后，對臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

雷帕霉素；膠質(zhì)瘤；RECQ1

神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma）也稱膠質(zhì)細胞瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40%～50%，根據(jù)起源的細胞成分分為星形細胞瘤，少突膠質(zhì)細胞瘤，室管膜瘤，髓母細胞瘤，多形性膠質(zhì)母細胞瘤［1］。本病臨床表現(xiàn)為顱內(nèi)壓增高癥狀如頭痛、視神經(jīng)乳頭水腫、嘔吐等以及腫瘤壓迫腦組織所表現(xiàn)出來的體征，如視覺障礙、感覺障礙、語言障礙、運動障礙、病理反射陽性等［2］。本病多發(fā)于20～50歲人群，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計［3］，我國原發(fā)性顱內(nèi)膠質(zhì)細胞瘤的年發(fā)病率為3.5～6.3/10萬，并有逐年上升趨勢。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，本病人們更加重視疾病防治及預(yù)后，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取手術(shù)治療等療法，但術(shù)后極易復(fù)發(fā)，且術(shù)后并發(fā)癥嚴重，患者痛苦較大［4］。研究發(fā)現(xiàn)［5］，雷帕霉素能夠抑制腫瘤細胞DNA的復(fù)制，阻止癌細胞的繁殖，為手術(shù)徹底切除癌細胞帶來可能，提高術(shù)后療效，緩解患者痛苦，減輕不良反應(yīng)，改善其預(yù)后等。通過觀察瘤體解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白質(zhì)表達，來探究雷帕霉素對腦膠質(zhì)瘤患者的臨床療效，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年7月～2013年8月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院以腦膠質(zhì)細胞瘤為診斷而收入院患者50例，采用隨機數(shù)字表分為實驗組和對照組。實驗組25例，其中男19例，女6例，平均年齡（43.16±14.35）歲，星形細胞瘤10例，少突膠質(zhì)細胞瘤3例，室管膜瘤6例，髓母細胞瘤1例，多形性膠質(zhì)母細胞瘤5例；對照組25例，其中男21例，女4例，平均年齡（44.01± 13.64）歲，星形細胞瘤11例，少突膠質(zhì)細胞瘤4例，室管膜瘤5例，髓母細胞瘤1例，多形性膠質(zhì)母細胞瘤4例。患者病程0.4～2.1年，平均病程（1.6±0.4）年。2組患者的一般資料相仿，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 診斷標(biāo)準 ①臨床表現(xiàn)：顱內(nèi)壓增高癥狀如頭痛、視神經(jīng)乳頭水腫、嘔吐等；②體征：腫瘤壓迫腦組織所表現(xiàn)出來的體征，如視覺障礙、感覺障礙、語言障礙、運動障礙、病理反射陽性等；③CT或MRI可見腦組織占位性病變；④腫瘤標(biāo)記物NSE持續(xù)增高；⑤病灶組織病理活檢，是診斷金標(biāo)準，可明確診斷及區(qū)分病理級別［6］。

1.3 納入標(biāo)準 符合腦膠質(zhì)細胞瘤的診斷標(biāo)準；患者自愿參與本實驗，并簽署知情同意書；本實驗經(jīng)本院倫理學(xué)委員會批準。

1.4 排除標(biāo)準 心、肝、膽嚴重疾病；其他惡性腫瘤；患有艾滋病、病毒性肝炎等傳染病患者；神志異常以及近2個月來接受抗腫瘤治療的患者。

1.5 治療方法 50例患者入院后，行常規(guī)入院檢查，排除手術(shù)及麻醉禁忌癥，對照組行開顱切除腦腫瘤手術(shù)，參照臨床用藥指南，術(shù)前給予雷帕霉素膠囊（華北制藥股份有限公司，國藥準字H20100078），1mg，1次/天口服，連續(xù)服用14 d，停藥1周后行手術(shù)治療，手術(shù)方式、主刀醫(yī)生、器械護士與對照組相同。術(shù)中2組選取2組患者腦膠質(zhì)瘤組織，所有標(biāo)本采集后立即保存在-70℃深低溫冰箱中。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 RNA提?。河肧YBR GreenⅠReal-Time PCR方法檢測人體腦膠質(zhì)瘤細胞中目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。用超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0581）提取組織樣本中總RNA，引物序列見表1。實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，用紫外分光光度法測定RNA的含量。

表1 目的基因的實時定量RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequence of the target gene

1.6.2 逆轉(zhuǎn)錄：用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0744）進行反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進行，將RNA模板、引物、5×RT Buffer和RNase-freeWater溶解并置于冰上備用。將2μL Primermix試劑和10μL消化后RNA分別加入20μL反應(yīng)體系的第一部分，混勻。65℃孵育5min，迅速冰浴2min，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。繼續(xù)向以上反應(yīng)管中加入4μL 5×RT Buffer、2μL 0.1M DTT、1μL 10mM dNTP Each和1μL HiFi-MMLV Enzyme Mix試劑，輕輕吸打混勻，37℃孵育50min，70℃保溫10min。

1.6.3 PCR擴增產(chǎn)物相對定量分析：PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，溴化乙啶染色，通過成像分析scion軟件計算和比較RECQ1產(chǎn)物條帶的吸光度值，并與β-action條帶光密度值比較，計算出RECQ1在腦膠質(zhì)瘤組織中mRNA表達含量。

1.6.4 Western blot分析：將準備好的組織勻漿加入裂解液中，提取胞漿蛋白和膜蛋白進行電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜后依次加RECQ1多克隆抗體和相應(yīng)的第二抗，洗膜，放射自顯影后，洗像。用圖像采集和分析系統(tǒng)采集分析圖片，測定2組的吸光密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1mRNA的表達RTPCR結(jié)果 實驗組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1mRNA的表達較對照組腦膠質(zhì)瘤組織明顯減少，實驗組光密度值為（1.059±0.894）；對照組相應(yīng)條帶吸收光密度值為（1.657± 0.748）。統(tǒng)計學(xué)分析得出，2組瘤體解旋酶RECQ1mRNA表達比較存在差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.487，P＜0.05，見表2、圖1）。

表2 瘤體解旋酶RECQ1mRNA相對表達比較情況Tab.2 Comparison of tumor helicase RECQ1mRNA relative expression

圖1 腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)RECQ1mRNA表達1-3，實驗組；4-6，對照組Fig.1 Expression of RECQ1mRNA in brain glioma tissue 1-3，experiment group；4-6，control group

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1 Western blot結(jié)果

Western blot分析結(jié)果所示：2組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1均有蛋白表達，實驗組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1蛋白表達（0.952±0.021）顯著低于對照組（1.211± 0.024），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.684，P＜0.05），與RT-PCR結(jié)果相同，如表3、圖2。

表3 腦膠質(zhì)瘤組織瘤體解旋酶RECQ1蛋白電泳帶的灰度值Tab.3 Electro phoresis brand gray value of brain glioma tumor helicase RECQ1 protein

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1蛋白表達（Western blot）1-2為實驗組，3-5為對照組Fig.2 Expression of glioma tumor helicase RECQ1 protein 1-2，experiment group；3-5，control group

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，來源于神經(jīng)外胚層，其中以星形細胞瘤最常見，約占40%，其次為惡性度最高的多形性膠質(zhì)母細胞瘤，約占20%。目前主要是以手術(shù)聯(lián)合放化療治療為主，但是手術(shù)難以根除，對放、化療不敏感，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，術(shù)后并發(fā)癥多，5年生存率低［7］。因此如何誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞凋亡、控制細胞增殖、治愈膠質(zhì)細胞瘤成為目前研究的熱點難題［8］。最近研究表明［9］，RECQ1在大腸癌、甲狀腺癌、非小細胞肺癌、多形性膠質(zhì)母細胞瘤中存在高表達，并且RECQ1與惡性腫瘤患者預(yù)后差相關(guān)，因此如何抑制RECQ1，控制癌細胞的凋亡率，是現(xiàn)代治療腦膠質(zhì)細胞瘤新的治療思路。

本實驗RT-PCR結(jié)果顯示，實驗組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1mRNA的表達較對照組腦膠質(zhì)瘤組織明顯減少，實驗組光密度值為（1.059±0.894）；對照組相應(yīng)條帶吸收光密度值為（1.657±0.748）。統(tǒng)計學(xué)分析得出，2組瘤體解旋酶RECQ1mRNA表達比較存在差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot分析結(jié)果示：2組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1均有蛋白表達，實驗組腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1蛋白表達（0.952±0.021）顯著低于對照組（1.211± 0.024），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與RT-PCR結(jié)果相同。RT-PCR和Western blot分析結(jié)果證明，雷帕霉素膠囊能夠抑制腦膠質(zhì)瘤組織中瘤體解旋酶RECQ1 mRNA和蛋白的表達，控制癌細胞的DNA復(fù)制，誘導(dǎo)細胞凋亡。RecQ解旋酶是一類參與細胞內(nèi)DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄重組以及RNA接拼、核糖體組裝、蛋白質(zhì)翻譯，端粒穩(wěn)定的核苷酸酶，而RECQ1是RecQ解旋酶家族成員，對腫瘤細胞增殖與誘導(dǎo)腫瘤細胞DNA修復(fù)起到關(guān)鍵調(diào)控作用。雷帕霉素又稱西羅莫司，是一種既能抑制細胞增殖從G1期進入S期而阻斷T淋巴細胞活化，又能阻斷白細胞介素-2與其受體的結(jié)合的大環(huán)內(nèi)酯抗生素類免疫抑制劑［10-13］。研究表明［14-15］，雷帕霉素又是mTOR抑制劑，mTOR是P13K/Akt信息通路激酶，在膠質(zhì)細胞腫瘤增殖和發(fā)展過程中起到重要的調(diào)控作用，雷帕霉素通過抑制mTOR激酶活性，阻斷P13K/Akt/mTOR信息通路在腫瘤細胞繁殖中的調(diào)控作用，起到誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。相關(guān)研究報道［16］，RECQ1表達與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)，RECQ1在高級別膠質(zhì)瘤中高表達，在低級別膠質(zhì)瘤低表達，因此雷帕霉素通過抑制腫瘤細胞的繁殖，同時也抑制RECQ1表達。

綜上所述，雷帕霉素能夠抑制RECQ1mRNA和蛋白表達，抑制腫瘤細胞的DNA修復(fù)，抑制mTOR激酶活性，阻止腫瘤細胞增殖和發(fā)展，有效殺滅腫瘤細胞，控制腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展，提高術(shù)后療效，降低復(fù)發(fā)率，改善患者生活質(zhì)量，對臨床具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

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［4］李春濤.雷帕霉素對膠質(zhì)瘤細胞糖代謝的影響及其抗腫瘤機制研究［D］.中南大學(xué)，2013.

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（編校：譚玲）

Effect study of rapamycin on the expression of tumor helicase RECQ1 in glioma patients

GUO Cheng-yong1，LIANG Zhao-hui1，WEIKe-xin2，SUN Guo-zhu1，JIAO Bao-hua1Δ，ZHAO Zong-mao1

（1.Department of Neurosurgery，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050011，China；2.Department of Neurosurgery，The First Hospital of Baoding，Baoding 071000，China）

ObjectiveTo investigate the effects of rapamycin on the expression of glioma patients tumor helicase RECQ1.Methods50 glioma patients admitted to the department of neurosurgery in second hospital of hebeimedical university were selected and random ly divided into 2 groups，25 patients in control group，were treated with routine admission surgical treatment；25 cases in the experimental group，firstly were given rapamycin capsule 1mg，1 times/day orally，took 14 days in a row，and had surgical treatmentafter stopping drug aweek.Glioma tissue sampleswere taken during the operation，mRNA and protein expression of tumor helicase RECQ1 were detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）and Western blot.ResultsGlioma tumor helicase RECQ1 mRNA expression in the control group increased more significantly than experimental group，the optical density value in control group was（1.657±0.748），while the experimental group optical density valuewas（1.059±0.894），and the difference was statistically significant（P＜0.05）；allorganizations had the expression of tumor helicase RECQ1 protein，butgliomas tumor helicase RECQ1 protein expression in the experimental group patients（0.952±0.021）was significantly lower than that in the control group（1.211±0.024），and the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionRapamycin capsule could reduce the expression ofmRNA helicase RECQ1，inhibitDNA glial tumor cells of brain replication，effectively kill cancer cells，control the the progress of brain glioma，and improve prognosis，worth clinical promotion.

rapamycin；glioma；tumors helicase RECQ1

R730

A

1005-1678(2014）07-0138-03

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目（20130511）

郭成永，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：膠質(zhì)瘤，E-mail：onegcyong@126.com；焦保華，通信作者，女，博士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：膠質(zhì)瘤，E-mail：jiaobh2000@163.com。