王 武 謝金標(biāo) 楊天寶 盧輝山 張 捷

KAI1基因作為抑癌基因，CD44V6作為粘附分子，已被證明與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)KAI1、CD44V6蛋白的表達(dá)，旨在探討兩者與胃癌的臨床病理特征的關(guān)系及其相互關(guān)系，為在分子水平更準(zhǔn)確地判斷腫瘤的進(jìn)展提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

所有病例選自福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院2006年間手術(shù)切除且資料完整、診斷明確的原發(fā)性胃癌病例，共61例，20例距離腫瘤邊緣約10 cm的切緣作為正常組織對(duì)照?；颊咝g(shù)前均未經(jīng)放療和化療，術(shù)后病理證實(shí)為腺癌，組織學(xué)分類明確。組織塊保存完好，標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，石蠟包埋，行4 μm連續(xù)切片。61例胃癌患者中男性43例，女性18例，年齡25～79 歲。年齡>60歲28例，年齡≤60歲33例。高分化、中分化癌36例，低分化癌25例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例。浸潤(rùn)未超過漿膜層(T1+T2)16例，浸潤(rùn)超過漿膜層(T3+T4)45例。TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期20例， Ⅲ～Ⅳ期41例。

1.2 試劑與方法

鼠抗人CD44V6單克隆抗體(MAB-0038)購自福州邁新生物公司，鼠抗人KAI1單克隆抗體(SC-10722)購自北京中杉生物公司，工作液濃度為1∶150，即用型免疫組化超敏S-P試劑盒均購自福州邁新生物公司。免疫組化采用標(biāo)記的鏈霉素抗生物素蛋白-生物素免疫染色(Streptavidin-Peroxidase，SP)方法，采用PBS代替一抗作空白對(duì)照，己知陰性切片作陰性對(duì)照，已知陽性切片作陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

KAI1蛋白主要定位于細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)，陽性細(xì)胞呈明顯棕黃色或棕褐色； CD44V6蛋白主要定位于細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)。陰性對(duì)照為PBS代一抗。選擇5個(gè)以上高倍(×400)視野，計(jì)數(shù)不少于500個(gè)細(xì)胞。根據(jù)染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析評(píng)分，陽性細(xì)胞百分率<30%為0分， 30%～70%為1分，>70%為2分；腫瘤基本不著色為0分，色淺為1分，色深為2分。計(jì)算兩者評(píng)分之和，以得分0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為強(qiáng)陽性(++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用χ2檢驗(yàn)組間差異的顯著性，指標(biāo)間的相關(guān)關(guān)系用spearman相關(guān)分析，采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 KAI1蛋白及CD44V6蛋白在胃癌組織及癌旁正常胃組織中的表達(dá)

KAI1在癌旁正常胃組織中的陽性表達(dá)率(+～++)為 90.0%(18/20)。KAI1在胃癌組織中的陽性表達(dá)率(+～++)為 29.5%(18/61)，明顯低于在癌旁正常胃組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

CD44V6在癌旁正常胃組織中的陽性表達(dá)率(+～++)為 5.0%(1/20)。CD44V6在胃癌組織中的陽性表達(dá)率(+～++)為 65.6%(40/61)，明顯高于在癌旁正常胃組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 KAI1及CD44V6蛋白的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

KAI1蛋白及CD44V6蛋白的表達(dá)與年齡、性別無關(guān)(P>0.05)；與漿膜是否受侵犯、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān) (P<0.05)。見表1。

表1 KAI1及CD44V6在胃癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系/例

2.3 KAI1與CD44V6蛋白表達(dá)的關(guān)系

KAI1陰性表達(dá)的43例病例中，CD44V6陽性表達(dá)32例(74.4%)，而18例KAI1的陽性表達(dá)中，CD44V6陽性表達(dá)8例(44.4%)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩者差異具有顯著性意義(χ2=5.0499，P<0.05)，提示兩者間存在相關(guān)性，其負(fù)相關(guān)的密切程度為γ=-0.363。

3 討論

KAI1基因是1995年由Dong等[1]采用人類特異的Alu重復(fù)順序介導(dǎo)的PCR技術(shù)從人前列腺癌雜交細(xì)胞AT6.1中的11號(hào)染色體克隆出的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。KAI1基因轉(zhuǎn)錄編碼的蛋白質(zhì)與已知的CD82結(jié)構(gòu)相同，CD82是1種細(xì)胞膜糖蛋白，是4跨膜超家族(TM4SF)成員之一，具有4個(gè)高度保守疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)大的細(xì)胞外N端糖基化結(jié)構(gòu)域[1]。KAI1對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用可能與其對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)移和增生的影響、對(duì)新生血管形成的影響及調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附有關(guān)。TM4SF蛋白不僅能夠調(diào)節(jié)異型粘附，還具有促進(jìn)同型粘附的作用。研究發(fā)現(xiàn)KAI1/CD82和其它TM4SF分子可與整合素形成復(fù)合體，從而調(diào)節(jié)整合素的粘附功能，并影響整合素介導(dǎo)的細(xì)胞遷移[2]。TM4SF分子中一些成員如CD9、 CD63、 CD61、CD82之間可相互交聯(lián)，還可與人類白細(xì)胞抗原DR(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)復(fù)合體和非常晚出現(xiàn)抗原1(very late antigen-1，VLA-1)組成四分子交聯(lián)網(wǎng)，促進(jìn)細(xì)胞表面的蛋白定位，在信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞粘附及決定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方式等方面起著重要作用[3]。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染KAI1質(zhì)粒的大腸癌細(xì)胞同質(zhì)性粘附能力高于對(duì)照組，異質(zhì)性粘附及侵襲能力明顯低于對(duì)照組。Jee等[5]研究發(fā)現(xiàn)KAI1蛋白通過Src激酶(Src kinase)介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)細(xì)胞的同質(zhì)性粘附，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。Odintsova等[6]研究發(fā)現(xiàn)KAI1可與EGF受體相互作用，下調(diào)EGF與相應(yīng)受體的結(jié)合，致使EGF誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)迅速衰減，上皮細(xì)胞的板狀偽足的伸展和細(xì)胞的遷移明顯受抑制，從而抑制新生血管的形成，最終抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。Zheng等[7]研究發(fā)現(xiàn)，KAI1在正常胃黏膜中表達(dá)顯著高于胃異型增生和胃癌。KAI1表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、轉(zhuǎn)移、Lauren分型、生長(zhǎng)方式和組織學(xué)分型相關(guān)，而與腫塊大小、Borrmann分型和TNM分期無關(guān)。推測(cè)KAI1的缺失表達(dá)在胃癌的發(fā)生、進(jìn)展中起著重要作用，可以作為預(yù)測(cè)胃癌進(jìn)展的客觀有價(jià)值的指標(biāo)。Tsutsumi等[8]研究發(fā)現(xiàn)KAI1蛋白在正常胃上皮細(xì)胞中高表達(dá)，在胃原發(fā)癌中低表達(dá)。KAI1蛋白的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位無關(guān)，而與胃癌組織學(xué)類型、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。KAI1陰性表達(dá)的患者在總體生存率方面較KAI1陽性表達(dá)的患者預(yù)后差，但是KAI1的缺失表達(dá)并不是獨(dú)立性的預(yù)后因素。我們的研究與Tsutsumi等的研究結(jié)果相似，提示KAI1的表達(dá)下調(diào)可能與胃癌細(xì)胞的分化不良有關(guān)，KAI1蛋白在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中起抑制作用，KAI1蛋白的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致胃癌更具有惡性侵襲性，更易于發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此， KAI1蛋白可作為判斷胃癌生物學(xué)行為的指標(biāo)。

CD44分子是CD44基因的表達(dá)產(chǎn)物，是1種細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，是細(xì)胞的粘附分子之一，含有變異型V6外顯子的CD44變異體，其肽鏈位于細(xì)胞外區(qū)靠近跨膜區(qū)部位能與層粘連蛋白和IV型膠原蛋白結(jié)合。本研究結(jié)果顯示，CD44V6主要定位于細(xì)胞胞膜及胞質(zhì)上，在胃癌中的表達(dá)率為65.6%，顯著高于其在正常胃組織中的表達(dá)(P<0.01)，這與孫喜文等[9]研究結(jié)果相近。孫喜文等[9]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌原發(fā)灶CD44V6陽性表達(dá)率為62%，Ⅲ-Ⅳ期胃癌CD44V6陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期，癌組織侵及漿膜層者的CD44V6陽性率明顯高于未侵及漿膜層者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CD44V6的陽性率明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組，認(rèn)為CD44V6表達(dá)強(qiáng)度與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病期進(jìn)展有關(guān)，其陽性預(yù)示胃癌具有更強(qiáng)的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，容易向周圍組織擴(kuò)散。CD44V6的出現(xiàn)改變了腫瘤細(xì)胞表面粘附分子的構(gòu)成和功能，使腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。CD44V6的過度表達(dá)可使腫瘤細(xì)胞牢固地錨定在宿主細(xì)胞基膜及細(xì)胞外間質(zhì)中，形成穩(wěn)定的侵襲或轉(zhuǎn)移；而CD44V6的過度表達(dá)又使得腫瘤細(xì)胞周圍的透明質(zhì)酸濃度上調(diào)，細(xì)胞間質(zhì)的高滲狀態(tài)促使其吸收水分，造成細(xì)胞外間質(zhì)的致密結(jié)構(gòu)被破壞，促使腫瘤細(xì)胞向周圍侵襲轉(zhuǎn)移[10]。CD44V6在腫瘤細(xì)胞上的過度表達(dá)，使得腫瘤細(xì)胞模擬淋巴細(xì)胞的“歸巢”過程，與遠(yuǎn)隔部位的血管及淋巴管內(nèi)的受體結(jié)合，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[11]。因此CD44V6可作為判斷胃癌生物學(xué)行為的指標(biāo)。

KAI1蛋白及CD44V6在胃癌中表達(dá)具有負(fù)相關(guān)性，表明KAI1蛋白及CD44V6在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中起相互制約的作用。

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