曾 瑋 劉孟剛 劉宏鳴 謝 斌 袁 濤 楊俊濤 藍 翔 陳 平

胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病隱匿,預后差,死亡率高,治療手段有限[1]。而PDAC的發(fā)生發(fā)展過程中，相關mRNA與ncRNA應該是一個相互調(diào)控的動態(tài)網(wǎng)絡過程[2-3]。據(jù)此，本文嘗試分析胰腺癌RNA表達數(shù)據(jù)庫內(nèi)多套mRNA與miRNA的表達譜數(shù)據(jù)，定義差異表達的分子，并利用已知的“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-mRNA”構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡。定義新的PDAC基因與miRNA。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)一組miRlet-7家族miRNA分子可能在調(diào)控網(wǎng)絡中其到重要作用，可能參與調(diào)控ALDH1A1、ZEB1與HMGA等基因，影響PDAC的發(fā)生與發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤mRNA與miRNA表達譜數(shù)據(jù)

PDAC相關差異表達mRNA與miRNA數(shù)據(jù)來自于Pancreatic Expression Database(PED)數(shù)據(jù)庫[4]。在數(shù)據(jù)庫內(nèi)篩選出比較PDAC組織樣本與正常組織樣本(包括配對樣本和非配對樣本)的mRNA表達譜數(shù)據(jù)集共12組，得到差異表達基因(t testP<0.05，|Fold Change|>2)。同時，篩選出比較PDAC組織樣本與正常組織樣本(包括配對樣本和非配對樣本)的miRNA表達譜數(shù)據(jù)集共6組，得到差異表達基因(t testP<0.05，|Fold Change|>2)。

1.2 miRNA與mRNA調(diào)控關系數(shù)據(jù)及miRNA疾病相關數(shù)據(jù)庫

miRNA與mRNA調(diào)控關系數(shù)據(jù)均為文獻報道證實數(shù)據(jù)。其中，轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控miRNA數(shù)據(jù)來源于transmir數(shù)據(jù)庫[5]。miRNA靶向調(diào)控mRNA數(shù)據(jù)來自miRNAwalk數(shù)據(jù)庫[6]。miRNA與疾病關系數(shù)據(jù)來源于人類miRNA疾病數(shù)據(jù)庫(HMDD)[7]及人類miRNA疾病與生物學過程數(shù)據(jù)庫(PhenomiR)[8]。已知癌基因數(shù)據(jù)來自CGC(Cancer Gene Census)數(shù)據(jù)庫[9]，共收集488個已知癌基因。

1.3 構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡與核心調(diào)控子網(wǎng)絡

尋找所有差異RNA分子間存在的調(diào)控關系，包括“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA”以及“miRNA-mRNA”2種調(diào)控關系，最后將所有得到的不同分子間的調(diào)控關系進行整合，形成miRNA-RNA調(diào)控關系網(wǎng)絡。

核心調(diào)控子網(wǎng)絡定義：①所有子網(wǎng)絡中節(jié)點均為差異表達mRNA或者miRNA;②子網(wǎng)絡中轉(zhuǎn)錄因子、miRNA及靶基因至少各存在一個；③子網(wǎng)絡節(jié)點數(shù)不得少于5個。

2 結(jié)果

2.1 差異表達基因與差異表達miRNA

分析整理PED數(shù)據(jù)庫中的mRNA表達譜數(shù)據(jù)，共得到465個差異表達的基因。包括392個上調(diào)基因，73個下調(diào)基因。差異基因中有82個為已知癌基因[9]。所有差異表達基因用biNGO軟件[10]進行GOslim富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達基因大多富集到“細胞增殖”、“細胞分化”、“細胞骨架”及“細胞死亡”等功能(表1)。相關功能都與PDAC發(fā)生發(fā)展有密切關系[3]。

表1 差異表達基因GOslim功能富集結(jié)果

分析miRNA表達譜數(shù)據(jù)，得到97個差異表達的miRNA。包括87個上調(diào)的miRNA,10個下調(diào)的miRNA。97個miRNA其中有32個文獻報道與PDAC疾病相關[7-8]。另外部分miRNA有研究表明與其他腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。例如，hsa-mir-125a可以促進非小細胞肺癌細胞的侵襲功能[11]，hsa-miR-222可以影響子宮內(nèi)膜癌的細胞分化[12]。

2.2 構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡

通過transmir數(shù)據(jù)庫[5]，發(fā)現(xiàn)其中有33個差異表達的miRNA可被11個差異表達的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，形成48個“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA”的調(diào)控關系。同時通過miRNAwalk數(shù)據(jù)庫[6]，發(fā)現(xiàn)其中7個差異miRNA可能調(diào)控了47個靶基因，形成了126個“miRNA靶向mRNA”的關系。

將以上2種調(diào)控關系整合成一個包含轉(zhuǎn)錄因子、miRNA及靶基因的整合網(wǎng)絡。該網(wǎng)絡包含88個節(jié)點，涉及174個調(diào)控關系。其中差異表達基因52個，差異表達miRNA 36個。在整合網(wǎng)絡中，通過遍歷搜索發(fā)現(xiàn)6個miR-let-7家族(hsa-let-7i、hsa-let-7d、hsa-let-7b、hsa-let-7g、hsa-let-7c、hsa-let-7e)與周圍的分子形成一個涉及到13個節(jié)點的子網(wǎng)絡(表2)。其中EGR1、TGFB1及ZEB1為對miRNA有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子,ALDH1A1和HMGA2為靶基因。該5個基因全部屬于已知癌基因[9]；其中ALDH1A1基因目前已經(jīng)被證實與PDAC的預后直接相關，可被作為PDAC預后分子標記[13]。HMGA2也被證實與PDAC的惡性程度呈顯著正相關，是PDAC非常重要的標記分子[14]。Simone Brabletz等[2]證實ZEB1可與miR-200家族相互調(diào)控影響PDAC的發(fā)展。這一現(xiàn)象在網(wǎng)絡中已有所體現(xiàn)。此外，EGR1與TGFB1很早已被證明與PDAC的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關[3]。雖然目前已有文獻報道m(xù)iR-let-7家族在胰腺癌組織中呈高表達[15],然而還未有文獻報道m(xù)iR-let-7家族在PDAC發(fā)生發(fā)展過程中的分子機制，miR-let-7家族與ALDH1A1、ZEB1、HMGA2、TGFB1及EGR1等基因間的調(diào)控關系及其與PDAC的發(fā)生發(fā)展的關系，至今未見文獻報道。因此，通過miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，miR let-7與上述分子很可能存在調(diào)控關系，進而影響PDAC。

表2 核心調(diào)控子網(wǎng)絡中基因與miRNA的差異表達情況

3 討論

miRlet-7家族是生物體內(nèi)一組進化來源相同的miRNA分子，由于其序列相似，所以在某些情況下，其在生物體內(nèi)參與的功能有很多類似。目前，已有研究討論miRlet-7家族與細胞分化以及腫瘤的關系[16-17]，曲杰等[16]通過合成hsa-let-7b轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)其可以明顯降低細胞的遷移。Kong 等[17]發(fā)現(xiàn)hsa-let-7可以負向調(diào)控EZH2基因的表達，進而影響前列腺癌細胞的結(jié)構(gòu)域增殖。雖然，Kent等[15]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)let-7家族在胰腺癌中顯著高表達，但未深入研究miR let-7家族在胰腺癌中具體分子機制。本文利用PDAC的全基因組表達數(shù)據(jù)與miRNA表達數(shù)據(jù)，尋找定義神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中的核心mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡，并由此得到miR-let-7家族相關的“mRNA-miRNA”核心調(diào)控網(wǎng)絡。其網(wǎng)絡中所有其他基因與miRNA目前都已被大量文獻證實與PDAC的發(fā)生發(fā)展有重要關系。此外，部分mRNA-miRNA調(diào)控關系也已被研究證實與PDAC相關。所以可能提示，hsa-let-7家族可以與ALDH1A1、ZEB1、HMGA2、TGFB1與EGR1等基因相互調(diào)控并影響PDAC的發(fā)生發(fā)展。因此，深入研究miR-let-7家族與上述分子之間的具體調(diào)控機制，并如何影響PDAC的發(fā)生發(fā)展將是我們下一步工作的重點。

由于腫瘤發(fā)病機制的高異質(zhì)性與復雜性，目前研究積累的成果還遠遠不能解釋PDAC發(fā)病的分子機制[18]。定義PDAC相關癌基因與miRNA對研究其發(fā)病機理和治療診斷具有非常重要意義。我們利用大規(guī)模膠質(zhì)瘤樣本的RNA分子表達數(shù)據(jù)，代入“轉(zhuǎn)錄因子-miRNA-基因”數(shù)據(jù)，尋找PDAC發(fā)病的調(diào)控網(wǎng)絡。挖掘批量的PDAC相關分子調(diào)控機制與相關RNA分子。此外，我們未使用算法預測的miRNA/mRNA調(diào)控關系，只使用目前文獻報道過的mRNA/miRNA調(diào)控關系，提高了miRNA/mRNA調(diào)控網(wǎng)絡的準確性與穩(wěn)定性。我們相信，隨著癌癥基因與ncRNA的表達數(shù)據(jù)的進一步積累，同時，伴隨著miRNA與基因之間的調(diào)控關系數(shù)據(jù)的進一步增加。通過本文的mRNA/ncRNA調(diào)控網(wǎng)絡分析方法，將可以挖掘更多的潛在的腫瘤相關RNA分子。

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