峗淑莉 馮起校 劉振海

在胃癌中，腹腔內轉移是比較常見的事件，也是晚期胃癌患者死亡的常見原因之一，胃癌患者合并腹腔內轉移，5年生存率只有2%，且對各種治療包括全身化療、腹腔內化療效果很差。近年來的研究表明，趨化因子與其受體結合后通過激活一系列細胞內信號轉導通路及效應分子參與多種腫瘤的轉移過程。目前對于趨化因子及其受體研究較多的是CXCL12-CXCR4軸。本研究擬通過免疫組化的方法和Transwell小室遷移實驗觀察CXCR4的表達與胃癌腹腔轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

自2009年4月至2013年3月從本院外科手術切除的胃癌病例中選取63例免疫組化的胃癌組織標本，其中腹腔轉移(包括淋巴結轉移、腹膜轉移)29例，無腹腔轉移34例。所有病例均由組織病理學檢查證實，術前均未接受放化療。Transwell小室遷移實驗中研究對象是胃癌SGC7901細胞。

1.2 材料與試劑

鼠抗人CXCR4單克隆抗體購自Santan Cruz公司，免疫組織化學SP試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。Transwell小室模型購自Corning公司。

1.3 免疫組化方法

①胃癌組織標本給予10%甲醛處理，并常規(guī)石蠟包埋后制備4 μm厚連續(xù)切片。②切片脫脂后，經0.3%過氧化氫-甲醇溶液浸泡30 min，以使內源性過氧化物酶失活。③將切片放入盛有0.01 mol/L 檸檬酸緩沖液(pH 6.0)的高壓滅菌器內加熱到120 ℃ 5 min。④室溫下將切片放入1%白蛋白的磷酸緩沖液(PBS)中孵育30 min，以減少非特異性著色。⑤在室溫下滴加CXCR4一抗孵育1 h。⑥室溫中將處理過的切片放入二抗標記的過氧化物酶液中孵育15 min。⑦切片經蘇木精著色。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 免疫組化結果判定

陽性判定標準：根據(jù)Mattern等[1]的陽性表達判斷的計數(shù)方法，CXCR4陽性細胞著色定位于細胞質或細胞膜，采用盲法對所有切片進行計數(shù)。陽性細胞指的是染色后呈現(xiàn)棕黃色的細胞，或者是棕褐色的細胞。每張切片于腫瘤區(qū)域隨機取高倍視野100個(×400)，從每個視野中讀取200個細胞計數(shù)陽性細胞數(shù)，算出每個視野的陽性率，對所有視野的陽性率計算平均值。

統(tǒng)計指標：參照Iwasa等[2]研究中胃癌細胞中染色強度標準，采用視覺評分等級，將CXCR4的表達劃分為4個等級。無CXCR4免疫染色的為等級0；CXCR4免疫染色數(shù)<10%的為等級1+；CXCR4免疫染色數(shù)≥10%～50%的為等級2+；CXCR4免疫染色數(shù)>50%的為等級3+。

1.5 Transwell小室遷移實驗方法

接種5×104/100 μl的胃癌SGC7901細胞至Transwell小室的上室，實驗組在下室加27 μl含CXCL12趨化因子(1640培養(yǎng)基加0.5%BSA加100 ng/ml CXCL12)的液體誘導其遷移。對照組下室只加1640培養(yǎng)基(含0.5%BSA)，置于飽和濕度是37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)15 h，隨后取出小室，將上層細胞用棉簽擦去，常溫下在4%多聚甲醛中固定15 min。在PBS洗2次后風干，再用0.1%結晶紫染色15 min，用純水洗3次，風干。置于顯微鏡下觀察，各取5個200×視野，計算穿膜細胞的數(shù)量，并且算出每個視野中平均穿膜細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包(SPSS，Chicago，IL)進行分析，計量資料均以均數(shù)±標準差表示，計數(shù)資料以百分比表示，免疫組化CXCR4表達陽性率的比較采用χ2檢驗，Transwell小室遷移實驗的比較采用t檢驗。相關性采用多元素分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CXCR4在有無腹腔轉移的胃癌組織中的表達情況

免疫組化顯示CXCR4在胃癌細胞的胞膜或胞質中表達，在有腹腔轉移(淋巴結轉移19例，腹膜轉移10例)的胃癌中，CXCR4的陽性表達率為72.41% (21/29)，在無腹腔轉移的胃癌組織中，CXCR4的陽性表達率為38.23%(13/34)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.359，P<0.05)。

2.2 CXCR4的表達與胃癌臨床病理的關系

CXCR4的表達與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度均無關，而與腹腔轉移的有無有顯著關系，見表1。

表1 CXCR4與胃癌臨床病理參數(shù)的關系(例，%)

2.3 CXCL12-CXCR4軸對胃癌細胞遷移的影響

通過Transwell小室遷移實驗發(fā)現(xiàn)，在Transwell小室下室中加入趨化因子CXCL12，能促進胃癌細胞SGC7901的遷移。實驗組的穿膜細胞數(shù)為(52.80±6.69)個細胞，對照組為(27.80±8.23)個細胞，P=0.001，2組間差異有統(tǒng)計學意義，提示CXCL12-CXCR4軸對胃癌細胞遷移有重要的作用。

3 討論

本研究采用免疫組化的方法探討了CXCR4在有腹腔轉移及無腹腔轉移的胃癌手術切除標本中的表達情況，并通過Transwell小室遷移實驗驗證CXCL12-CXCR4軸對胃癌細胞遷移的影響。研究結果表明CXCR4的陽性表達與胃癌的腹腔轉移是有密切關系的，CXCL12-CXCR4軸可作為評估胃癌腹腔轉移的1個觀測指標。

趨化因子不僅對淋巴細胞歸巢和免疫功能的保持起到非常重要的作用，而且也影響到血管再生、膠原蛋白的合成、骨髓細胞的生成。已有研究證明，趨化因子系統(tǒng)是上皮腫瘤細胞的產生機制之一，能夠調節(jié)白細胞轉移和歸巢。腫瘤細胞的趨化因子受體表達在腫瘤生物學中起到至關重要的作用，尤其是，CXCR4的表達與不同腫瘤細胞在體內外的表現(xiàn)之間的關系更為密切[3]。在正常組織中CXCR4廣泛表達，對胎兒生長、造血干細胞的運作以及淋巴細胞轉移起著基礎性的作用[4]。

CXCL12-CXCR4軸在胃癌的演進過程中起著重要的調控作用。Ishigami等[5]通過免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)，在185例胃癌患者的胃癌組織學標本中，有74例CXCL12陽性表達，且其陽性表達與胃癌淋巴結轉移、浸潤深度、淋巴管浸潤、腫瘤最大直徑及臨床分期有關。Lee等[6]對5種胃癌細胞系采用反轉錄酶-聚合酶鏈鎖反應( RT-PCR)、蛋白質印跡、流式細胞術和共聚焦顯微鏡方法研究CXCR4的表達情況，探討221例胃癌患者中CXCR4表達和臨床特征之間的關系。結果表明，CXCR4表達與淋巴結轉移顯著相關，并且與存活率的減少也相關，CXCR4的表達與胃癌細胞體內移行有關，在胃癌惡化中起到重要的作用。徐斌等[7]采用S-P 免疫組化法及RT-PCR探討胃癌組織中CXCR4 和MMP-9 的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)，胃癌CXCR4和MMP-9 的表達之間存在一定相關性，兩者的表達與胃癌淋巴結轉移呈正相關。本研究也證實了胃癌腹腔轉移與CXCL12的受體CXCR4在胃癌中的表達相關，與腫瘤大小、浸潤深度無關，可能與本研究標本例數(shù)較少有關。Yasumoto等[8]認為趨化因子與胃癌腹膜種植轉移的發(fā)展有關系，在檢驗臨床患者中發(fā)現(xiàn)，來自有腹膜癌病者的惡性腹腔積液中含有高濃度的CXCL12 (4.67 ng/mL)，免疫組織化學分析表明，2/3的有腹膜轉移的胃癌中CXCR4表達，然而有1/4的遠處轉移胃癌的CXCR4的表達陽性。CXCR4表達的原發(fā)腫瘤中85%會發(fā)展成腹膜轉移。原發(fā)性胃癌的CXCR4表達與腹膜種植轉移的發(fā)展顯著相關。CXCR4/CXC12軸在胃癌的腹膜種植轉移的發(fā)展中起重要的作用。這與本研究結果相一致。他們的動物實驗發(fā)現(xiàn)在裸鼠體內注入人的胃癌細胞系會形成大量的惡性腹腔積液，并有選擇地表達CXCR4 mRNA，尤其是，NUGC4細胞表達出高濃度的CXCR4 mRNA，快速增強了蛋白激酶B/Akt的磷酸化作用，在裸鼠體內AMD3100(一種特殊的CXCR4拮抗劑)能夠有效地減緩腫瘤生長和惡性腹腔積液的形成。

本研究也用Transwell小室模型體外證實了CXCL12-CXCR4軸能促進胃癌細胞SGC7901的遷移。關于CXCL12-CXCR4軸影響胃癌腹腔內轉移的機制，目前只有少數(shù)的報道，Hashimoto等[9]發(fā)現(xiàn)CXCL12促進胃癌的腹腔內播散是通過激活mTOR通路，升高基質金屬蛋白酶的表達，增強轉移能力。CXCL12-CXCR4軸影響胃癌腹腔內轉移的機制的深入研究，將為治療胃癌合并腹腔內轉移提供新的治療靶點，并為進一步治療和預防胃癌的淋巴結轉移提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎。

[1] Mattern J，Koomagi R，Volm M.Associalion of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel densilv and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma〔J〕.Br J Cancer，1996，73(7)：931-934.

[2] Iwasa S，Yanagawa T，F(xiàn)an J，et al.Expression of CXCR4 and its ligand SDF-1 in intestinal-type gastric cancer is associated with lymph node and liver metastasis〔J〕.Anticancer Res，2009，29(11)：4751-4758.

[3] Kucia M，Jankowski K，Reca R，et al.CXCR4-SDF-1 signalling，locomotion，chemotaxis and adhesion〔J〕.J Mol Histol，2004，35(3)：233-245.

[4] Rossi D，Zlotnik A.The biology of chemokines and their receptors〔J〕.Annu Rev Immunol，2000，18：217-242.

[5] Ishigami S，Natsugoe S，Okumura H，et al.Clinical Implication of CXCL12 Expression in Gastric Cancer〔J〕.Ann Surg Oncol，2007，14(11)：3154-3158.

[6] Lee HJ，Kim SW，Kim HY，et al.Clinical implication of CXCL12 expression in gastric cancer〔J〕.Int J Oncol，2009，34(2)：473-480.

[7] 徐 斌，韓紹偉，周笑珍，等.CXCR4 和 MMP-9 在胃癌組織中表達及其與淋巴結轉移的關系〔J〕.醫(yī)學研究雜志，2012，41(4)：112-115.

[8] Yasumoto K，Koizumi K，Kawashima A，et al.Role of the C-XCL12/CXCR4 axis in peritoneal carcinomatosis of gastric cancer〔J〕.Cancer Res，2006，66(4)：2181-2187.

[9] Hashimoto I，Koizumi K，Tatematsu M，et al.Blocking on the CXCR4/mTOR signalling pathway induces the anti-metastatic properties and autophagic cell death in peritoneal disseminated gastric cancer cells〔J〕.Eur J Cancer，2008，44(7)：1022-1029.