景彩霞，楊加周，龐秋霞，艾慶燕，王艷梅，趙豫鳳

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室；2.組織胚胎教研室；3.生物化學(xué)教研室，陜西 延安 716000)

GATA家族可分為GATA-1、-2、-3和GATA-4、-5、-6兩個(gè)亞家族，前者主要在造血干細(xì)胞中表達(dá)，后者主要在內(nèi)胚源和中胚源組織(如心臟、睪丸和卵巢等)中表達(dá)。該家族每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子都含有兩個(gè)鋅指組成的一個(gè)高度保守的DNA結(jié)構(gòu)域，在此之外的序列則有較大的差異[1]。自1996年Huang等研究者應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)將GATA-4基因定位于人8p23.1→p22染色體上[2]之后。大量研究結(jié)果表明GATA-4在動(dòng)物生殖細(xì)胞的分化和生殖過程中多種激素的調(diào)節(jié)上可能起著必不可少的作用[3]。本課題組為了探討GATA-4在睪丸性別決定和分化以及卵巢中卵泡的發(fā)育、閉鎖等方面的調(diào)控，對(duì)小鼠睪丸和卵巢內(nèi)GATA-4免疫反應(yīng)產(chǎn)物的分布與特征進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 生長轉(zhuǎn)錄因子GATA-4IgG多克隆抗體，由美國Santa公司(Santa Cruz Biotechnogy,Inc)提供；生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG(GAR-b)和辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(Streptavidin/HRP)等試劑來自美國Sigma公司產(chǎn)品。對(duì)照試劑正常山羊抗體，甲基綠等由日本Nagoya公司提供。

1.1.2 動(dòng)物 選取由日本Kanagawa公司提供來源于美國癌癥研究所的雌性和雄性小鼠各6只，飼養(yǎng)室溫度及濕度與外界環(huán)境一致，定時(shí)定點(diǎn)常規(guī)投喂食物。

1.2 方法

1.2.1 取材及組織處理 選用同一批次6周齡雌雄小鼠各6只，用乙醚將實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉，稱重后快速取出雌性小鼠卵巢和雄性小鼠睪丸，置于含4%的多聚甲醛固定液中待用。將組織切成0.5 cm3左右大小的方塊，在4%的多聚甲醛溶液中充分固定24h后，用PH為7.4的0.01 mol/L PBS液洗3次，并進(jìn)行脫水、包埋，制成5 μm厚石蠟切片。

1.2.2 免疫組化-ABC法 先將石蠟組織切片在60℃恒溫箱中烘烤20 min后，經(jīng)二甲苯及酒精脫蠟和水化，PBS清洗2次，用水浴鍋加熱放入組織切片的0.01 M枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)95℃左右10 min，進(jìn)行抗原修復(fù)。待緩沖液冷卻后用PBS浸泡，用0.3%H2O2室溫封閉以消除內(nèi)源性過氧化物酶。PBS液洗3次，滴加5%正常山羊血清室溫下封閉60 min。滴加稀釋的一抗GATA-4 IgG(1∶100)，4℃冰箱孵育24 h，PBS沖洗3次，每次5 min。滴加生物素化羊抗免二抗作1∶100倍稀釋，室溫孵育30 min，PBS洗滌；辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(1∶100)，滴加在切片上，室溫孵育30 min，再用PBS洗滌；DAB顯色；蒸餾水沖洗，甲基綠復(fù)染。對(duì)照組的一抗用正常山羊抗體代替，其余步驟同上。

2 結(jié)果

在6周小鼠的睪丸組織中Sertoli細(xì)胞、Leydig細(xì)胞和生精細(xì)胞(圖A)均有GATA-4的表達(dá)，說明本實(shí)驗(yàn)顯示陽性結(jié)果具有特異性。6周小鼠的卵巢組織中初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中GATA-4的表達(dá)較多，卵泡膜細(xì)胞上有少量的分布(圖C)。陰性對(duì)照組的一抗用正常山羊抗體代替，結(jié)果均為陰性無明顯表達(dá)產(chǎn)物(見圖B、圖D)。

A 小鼠睪丸組織GATA-4免疫組化結(jié)果(黑色箭頭示Sertoli細(xì)胞，白色空心箭頭示Leydig細(xì)胞，紅色箭頭示生精細(xì)胞。)B 小鼠睪丸組織陰性對(duì)照C 小鼠卵巢組織GATA-4免疫組化結(jié)果(黑箭頭示顆粒細(xì)胞，紅箭頭示卵泡內(nèi)膜細(xì)胞。)D 小鼠卵巢組織陰性對(duì)照

3 討論

GATA家族可在哺乳動(dòng)物生殖腺中的多種細(xì)胞中表達(dá)，參與動(dòng)物的性別決定和生殖功能，在調(diào)控生殖系統(tǒng)中扮演著重要的角色[4，5]。Sertoli細(xì)胞具有營養(yǎng)生精細(xì)胞和調(diào)節(jié)生精細(xì)胞周期作用的體細(xì)胞，胚胎時(shí)期Sertoli細(xì)胞分泌抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)使中腎管發(fā)育，中腎旁管退化，胚胎發(fā)育為男性。GATA-4轉(zhuǎn)錄因子能與SF-1轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)節(jié)，從而激活A(yù)MH啟動(dòng)報(bào)告基因的活性，使雄激素增強(qiáng)中腎管系統(tǒng)的發(fā)育和中腎旁管的單向退化，進(jìn)而影響性別分化[6，7]。反之在胚胎時(shí)期缺乏Sertoli細(xì)胞分泌AMH，使中腎旁管發(fā)育，中腎管退化，胚胎發(fā)育為女性。小鼠性成熟期一般在6周齡，筆者研究發(fā)現(xiàn)GATA-4在6周的小鼠Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞中陽性表達(dá)，這與精子的成熟與GATA-4對(duì)Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞的調(diào)控有關(guān)[8]相一致。GATA-4還在小鼠的胎兒期的生精細(xì)胞與性成熟期的生精細(xì)胞有表達(dá)，推測(cè)其可能參與精子的發(fā)生過程的調(diào)節(jié)，這與Ketola等[9]報(bào)道的有所不同。

卵泡發(fā)育是由原始卵泡到初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡至排卵的一個(gè)復(fù)雜過程，其顯著特征是僅有少數(shù)卵泡發(fā)育成熟，大多數(shù)卵泡則閉鎖退化。2001年Vaskivuo等[10]研究認(rèn)為卵泡閉鎖與顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)，顆粒細(xì)胞凋亡在發(fā)育晚期卵泡閉鎖中起主導(dǎo)作用。國外研究表明GATA-4參與動(dòng)物和人的卵泡發(fā)育并在卵泡發(fā)育過程的顆粒細(xì)胞中表達(dá)，其在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平隨著顆粒細(xì)胞增殖活性而增加[7，11]。即在優(yōu)勢(shì)卵泡的顆粒細(xì)胞中GATA-4的表達(dá)量隨著卵泡發(fā)育不斷增高，卵泡發(fā)育至排卵前狀態(tài)時(shí)GATA-4 mRNA表達(dá)到最高值。而在非優(yōu)勢(shì)卵泡中，GATA-4在所有顆粒細(xì)胞中的表達(dá)在卵泡通過程序性死亡發(fā)生卵泡閉鎖之前急劇下降[11，12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6周齡小鼠的卵巢組織中初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞中GATA-4的表達(dá)較多，卵泡膜細(xì)胞上有少量的表達(dá)。

促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是由下丘腦合成的十肽激素，主要功能是控制卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)的釋放，在性別分化、性腺發(fā)育以及生殖過程中起重要調(diào)節(jié)作用。Lawson等[13]研究表明GATA-4對(duì)GnRH的特異性表達(dá)起著重要的調(diào)節(jié)作用，會(huì)誘導(dǎo)GnRH的大量分泌即影響FSH和LH等激素，從而調(diào)控了睪丸和卵巢激素的分泌。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6周小鼠的睪丸中陽性Sertoli細(xì)胞和Leydig細(xì)胞及卵巢的各期卵泡中的陽性顆粒細(xì)胞和少量的卵泡內(nèi)膜細(xì)胞，故推測(cè)GATA-4可能參與睪丸中雄激素的分泌與調(diào)節(jié)，在維持睪丸內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定的同時(shí)參與了精子的發(fā)生與形成，尤其是GATA-4在青春期前后的睪丸細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較高。另外GATA-4在優(yōu)勢(shì)卵泡的顆粒細(xì)胞中的持續(xù)表達(dá)可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖分化和通過顆粒細(xì)胞和卵泡內(nèi)膜細(xì)胞調(diào)節(jié)卵泡的凋亡、成熟和排卵，調(diào)控了月經(jīng)周期和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。至于GATA-4通過何種途徑促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖分化和抑制顆粒細(xì)胞凋亡，GATA-4基因發(fā)生突變或者敲除該基因是否會(huì)阻斷卵泡的發(fā)育或閉鎖過程等問題還有待進(jìn)一步探索。

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