李 玲，劉文康，楚雍烈，劉 湘，任健康

(1.陜西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 7100682.西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物系，陜西 西安 710061)

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科腫瘤之一。大量流行病學(xué)和分子生物學(xué)資料已證實(shí)，宮頸癌發(fā)生與人類乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus ,HPV)感染有密切關(guān)系。高危型HPV致癌機(jī)制為HPV基因組與宿主細(xì)胞染色體整合后，其E2蛋白閱讀框發(fā)生缺失，使病毒癌基因E6/E7表達(dá)缺乏E2蛋白的抑制，導(dǎo)致癌基因表達(dá)增強(qiáng)，誘導(dǎo)細(xì)胞惡性變[1-2]。然而部分宮頸癌組織中只發(fā)現(xiàn)游離型HPV，其致癌機(jī)制尚未完全清楚。HPV 長(zhǎng)控制區(qū)(LCR)內(nèi)含有乳頭瘤病毒基因組復(fù)制起點(diǎn)和基因表達(dá)所必需的調(diào)控元件。LCR中的細(xì)胞型特異性增強(qiáng)子(Cell-type Specific Enhancer,CTSE)含一系列細(xì)胞因子特異結(jié)合位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，HPV16長(zhǎng)控制區(qū)的變異現(xiàn)象較為普遍，其變異對(duì)E6/E7癌基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)影響以及在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而且在HPV16 LCR內(nèi)的變異多發(fā)生在CTSE片段中[3]， 這提示CTSE片段可能在致癌機(jī)理方面有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室曾對(duì)來(lái)自陜西省的宮頸癌標(biāo)本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中游離型HPV16 CTSE片段存在特定的變異，即存在nt7481-nt7489處YY1位點(diǎn)突變[4]。YY1位點(diǎn)突變有可能使YY1蛋白喪失對(duì)HPV16 E6/E7癌基因P97啟動(dòng)子活性的抑制,導(dǎo)致E6/E7癌基因表達(dá)增強(qiáng)。顯然，實(shí)驗(yàn)證明上述位點(diǎn)突變對(duì)啟動(dòng)子功能的影響，對(duì)于了解游離型HPV16致宮頸癌的分子機(jī)理是十分必要的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

宮頸癌組織為本室先前證實(shí)并保存的攜帶游離型HPV16的宮頸癌組織標(biāo)本。其CTSE片段序列突變(nt7480-nt7482,A→C的替換)。質(zhì)粒pUC19和PBR322/HPV16質(zhì)粒由本室保存。pUCm-T載體購(gòu)自上海生工生物有限公司，pCAT3-Promoter(含SV40啟動(dòng)子，啟動(dòng)子上游為多克隆位點(diǎn)，可插入調(diào)節(jié)啟動(dòng)子活性的序列；下游為CAT報(bào)道基因)載體購(gòu)自Promega公司。DMEM購(gòu)自GIBCO BRL 公司。過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔Ig G購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心。抗CAT蛋白抗體，預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所高晨博士惠贈(zèng)。大腸桿菌JM109株，本室保存。HeLa細(xì)胞，本室保存。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建含HPV16 突變型及野生型CTSE片段的中間載體 分別以HPV16質(zhì)粒及1例存在游離型HPV16的宮頸癌標(biāo)本DNA(已測(cè)序證實(shí)其CTSE序列存在突變位點(diǎn))為模板,設(shè)計(jì)CTSE片段特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出野生型及突變型CTSE片段。 引物1：5’—GAATTCGGTTGCATG CTTTT—3’引物2：5’—ACTAGGGTGACATTTAGTTGG—3’按pUCm-T試劑盒操作說(shuō)明，將PCR產(chǎn)物CTSE片段與pUCm-T連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌，藍(lán)白斑篩選工程菌。挑取白色菌落提取重組質(zhì)粒，分別命名為pUCm-T-CTSE1(野生型)和pUCm-T-CTSE2(游離突變型)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切分析及測(cè)序。

1.2.2 野生型及突變型CTSE-CAT報(bào)道載體的構(gòu)建

將分別含野生型及突變型CTSE-T載體進(jìn)行Kpn I+Bgl II雙酶切，回收野生型及突變型CTSE片段，再與同樣雙酶切的pCAT3-Promoter報(bào)道基因載體進(jìn)行連接反應(yīng)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒DNA。重組質(zhì)粒分別命名為pCAT-1(野生型)，pCAT-2(游離突變型)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天給HeLa細(xì)胞換液，細(xì)胞豐度達(dá)到90%時(shí)，按Lipofectamine 2000操作說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收獲細(xì)胞。-70℃反復(fù)凍溶3次，離心取上清。

1.2.4 細(xì)胞提取物中CAT蛋白ELISA檢測(cè) 將稀釋的細(xì)胞提取液包被后，5%的小牛血清/PBS封閉抗原孔。加入抗CAT蛋白抗體(工作濃度1∶500)，37℃溫育1 h，洗滌后加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(工作濃度1∶400)， 最后加入TMB底物緩沖液，室溫15 min，加入終止液。測(cè)OD450值。

2 結(jié)果

2.1 HPV16 野生型及突變型CTSE-T載體酶切分析

取白色菌落培養(yǎng)并提取質(zhì)粒 DNA進(jìn)行電泳初篩，選取質(zhì)粒DNA分子量較大的菌落提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析及Kpn I+Bgl II雙酶切分析。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)兩條帶，其中大片段分子量約2.7 kb，落后于重組pUCm-T質(zhì)粒(3 kb); 小片段分子量約為0.3 kb，與預(yù)期相符，證明插入了目的基因。

1.Lambda DNA/HindIII Marker 2.pUCm-T-CTSE1質(zhì)粒 3.pUCm-T-CTSE2質(zhì)粒 4.pUCm-T-CTSE1酶切產(chǎn)物 5.pUCm-T-CTSE2酶切產(chǎn)物 6.HPV16質(zhì)粒DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 7.100bp DNA LadderIII

2.2 DNA測(cè)序及序列比對(duì)結(jié)果

游離型HPV16 CTSE序列測(cè)序結(jié)果與原測(cè)序結(jié)果一致。與野生型HPV16 CTSE序列部分相比，nt7480，nt7481，nt7482處(下劃線處)發(fā)生A→C顛換。

圖2 游離型HPV16 CTSE序列突變位點(diǎn)

2.3 HPV16野生型及突變型CTSE-CAT報(bào)道載體酶切分析

挑取37℃培養(yǎng)24 h的氨芐青霉素抗性LB平板上菌落，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳初篩，選出分子量相當(dāng)于4.6 kb的菌落，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)一步進(jìn)行Kpn I+Bgl II雙酶切分析。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)兩條帶，其中大分子片段分子量約4.3 kb與空載體相當(dāng)；小片段分子量約為0.3 kb，與預(yù)期相符，證明插入了目的基因。

1.Lambda DNA/Hind Ⅲ Marker 2.pCAT3-Promoter質(zhì)粒 3.pCAT-1質(zhì)粒 4.pCAT-2質(zhì)粒 5.pCAT-1酶切產(chǎn)物 6.pCAT-2酶切產(chǎn)物 7.100 bp DNA LadderⅢ

2.4 CAT報(bào)道基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，與轉(zhuǎn)染無(wú)增強(qiáng)子的CAT報(bào)道質(zhì)粒pCAT3-Promoter相比，插入HPV16 CTSE 序列的重組報(bào)道質(zhì)粒(pCAT-1，pCAT-2) 的CAT蛋白表達(dá)量增加1.5～2.5倍。而插入突變型CTSE 序列的報(bào)道質(zhì)粒(pCAT-2)與插入野生型CTSE 序列報(bào)道質(zhì)粒(pCAT-1)相比,CAT蛋白表達(dá)量增加了1.6倍。并用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，它們之間有顯著性差異(P<0.01)。

圖4 不同HPV16 CTSE序列控制下的CAT蛋白表達(dá)

未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞為陰性對(duì)照，CAT相對(duì)表達(dá)值為3次轉(zhuǎn)染的均值(P<0.01)。

3 討論

在宮頸癌組織中，除存在有整合型的HPV16 DNA之外，其中有10～30%的HPV16 DNA是以游離態(tài)的形式存在[5]。游離型HPV16可表達(dá)E2蛋白。在E2蛋白的存在條件下，癌蛋白仍上調(diào)表達(dá)。其上調(diào)途徑的一個(gè)假說(shuō)是：由于LCR上，特別是細(xì)胞型特異性增強(qiáng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的缺失或突變，導(dǎo)致具有抑制轉(zhuǎn)錄活性的蛋白的抑制作用喪失。

YY1蛋白是一種遍在化蛋白，對(duì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄有調(diào)節(jié)作用，是具有多功能的轉(zhuǎn)錄因子[6]。可因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的不同或細(xì)胞環(huán)境的變化起到刺激或抑制轉(zhuǎn)錄活性的效應(yīng)。YY1蛋白可通過(guò)結(jié)合于HPV16 CTSE 上YY1位點(diǎn)，抑制P97啟動(dòng)子活性。研究發(fā)現(xiàn)，與其它細(xì)胞因子結(jié)合位點(diǎn)相比，HPV LCR序列中YY1位點(diǎn)突變相當(dāng)多。其突變可在完整基因組范圍內(nèi)明顯增強(qiáng)對(duì)小鼠纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力[7]，也可在完整基因組范圍內(nèi)增強(qiáng)病毒使人原代包皮角源細(xì)胞永生化的能力，并且可使HPV16癌基因啟動(dòng)子P97活性上調(diào)，E6/E7癌基因表達(dá)增強(qiáng)，在宮頸癌，特別是與游離型HPV相關(guān)宮頸癌的進(jìn)程中起著重要作用[8]。

本研究應(yīng)用 CAT報(bào)道基因載體pCAT3-Promoter，構(gòu)建了含HPV16 突變型及野生型CTSE片段序列的CAT報(bào)道基因載體系統(tǒng)。通過(guò)測(cè)定CAT蛋白的表達(dá)變化，研究HPV16 突變型及野生型CTSE片段對(duì)啟動(dòng)子活性影響。結(jié)果表明，與無(wú)增強(qiáng)子的CAT報(bào)道質(zhì)粒pCAT3-Promoter相比，插入HPV16 CTSE 序列的pCAT3-Promoter重組報(bào)道質(zhì)粒CAT蛋白表達(dá)量增加1.5～2.5倍。插入游離型突變的CTSE 序列(YY1位點(diǎn)突變)的報(bào)道載體與插入野生型CTSE 序列報(bào)道載體相比，其CAT蛋白表達(dá)量增加了約1.6倍，并用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(P<0.01)。表明游離型HPV16 CTSE YY1位點(diǎn)突變序列與野生型HPV16 CTSE序列相比，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性增強(qiáng)。這提示來(lái)自陜西地區(qū)宮頸癌組織的游離型HPV16，其 CTSE 上YY1位點(diǎn)的變異可使YY1蛋白對(duì)啟動(dòng)子活性的抑制減弱，使病毒癌基因啟動(dòng)子P97活性上調(diào)，病毒癌基因表達(dá)增多，從而誘使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

本研究中，來(lái)源于陜西地區(qū)宮頸癌組織中游離型HPV16 CTSE上并沒(méi)有觀察到AP1,NF1,NF-IL6結(jié)合位點(diǎn)等重要位點(diǎn)的變異。同樣來(lái)源的整合型HPV16 CTSE上未見(jiàn)YY1位點(diǎn)的變異。而且，整合型HPV16 LCR上存在YY1位點(diǎn)突變尚未見(jiàn)報(bào)道。這表明宮頸癌組織中游離型HPV16可能存在YY1位點(diǎn)的選擇性突變[9-10]。其原因可能是：變異是生物適應(yīng)環(huán)境和維持生存的一種重要方式。病毒侵入宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞必定采取各種方式對(duì)抗病毒感染，如誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生等。病毒面臨宿主的選擇壓力。有利于病毒生存復(fù)制的變異有可能保留下來(lái)。對(duì)于HPV16而言，感染宿主細(xì)胞后，宿主細(xì)胞試圖通過(guò)YY1蛋白來(lái)抑制病毒早期基因表達(dá)，干擾HPV16正常的基因表達(dá)過(guò)程及改變其基因調(diào)控機(jī)制。而病毒則通過(guò)自身序列YY1位點(diǎn)突變使細(xì)胞YY1蛋白不能與之結(jié)合，從而逃逸YY1蛋白的抑制作用，有利于HPV16生存復(fù)制。因此宮頸癌組織中游離型HPV16多呈現(xiàn)YY1位點(diǎn)突變。

值得注意的是，本研究中的CTSE突變位置在nt7480- nt7482，而且為單個(gè)YY1位點(diǎn)突變，與國(guó)外研究不同。因此，本實(shí)驗(yàn)中突變的CTSE上調(diào)啟動(dòng)子活性程度亦不同。本研究中的YY1位點(diǎn)突變，對(duì)啟動(dòng)子活性影響稍弱于同時(shí)有多個(gè)YY1位點(diǎn)突變，亦稍弱于其他YY1位點(diǎn)突變,如nt7777-nt7789上的YY1位點(diǎn)。此位點(diǎn)是圍繞nt7813-nt7819處AP1位點(diǎn)的YY1位點(diǎn)之一，在調(diào)控E6/E7轉(zhuǎn)錄的表達(dá)上有重要功能，nt7786處的單個(gè)堿基變化會(huì)使啟動(dòng)子活性增加4～6倍突變[3]。這表明突變YY1位點(diǎn)位置或數(shù)量不同，對(duì)啟動(dòng)子活性影響也不同。

綜合以上對(duì)本研究中游離型HPV16 CTSE序列突變結(jié)果、啟動(dòng)子活性影響的分析及國(guó)外研究，表明了陜西地區(qū) HPV16 YY1位點(diǎn)的突變與游離型HPV16 DNA 導(dǎo)致的宮頸癌發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。

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