唐岳鵬 胡潔 黃桂林

涎腺細胞的增殖和營養(yǎng)與交感副交感的神經(jīng)刺激、激素的調(diào)節(jié)有十分密切的關(guān)系［1］。β-腎上腺素能激動劑異丙腎上腺素注射后, 能夠在短時間內(nèi)促進嚙齒類動物涎腺腺泡細胞增殖、肥大［2］；誘導(dǎo)大鼠腮腺閏管細胞分裂增殖, 表現(xiàn)出腺泡細胞免疫組織化學(xué)性質(zhì)［3］。本文通過腹腔注射IPR, 觀察下頜下腺具有干/祖細胞特征細胞的增殖和功能變化。

1 材料與方法

1.1 材料 8周齡雄性Sprague-Dawlye大鼠(SD大鼠), 180～200 g,SPF級, 第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。鹽酸異丙腎上腺素(2 ml:1 mg, 上海禾豐制藥有限公司)。一抗：小鼠抗人淀粉酶單克隆抗體(Santa Cruz, USA)；兔抗大鼠Ki-67多克隆抗體 (武漢博士徳公司) 。二抗：Envision兩步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒, EDTA 抗原修復(fù)液, DAB 顯色試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 12只雄性SD大鼠隨機分成IPR注射組和對照組。IPR注射組按20 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射鹽酸異丙腎上腺素, 2次/d(8 AM, 8 PM), 連續(xù)注射5 d。對照組則以無菌生理鹽水代替鹽酸異丙腎上腺素腹腔注射。5 d后處死動物并取出腺體。將獲得的腺體進行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.2 免疫組化染色采用兩步法, 按試劑盒說明進行操作。

最后用DAB 顯色, 蘇木精復(fù)染。

2 結(jié)果

2.1 下頜下腺HE染色 IPR注射5 d后, 腺泡及腺泡細胞體積較對照組明顯增大。導(dǎo)管系統(tǒng)清晰, 導(dǎo)管細胞未見改變,見圖1(A和B)。

2.2 異丙腎上腺素注射后的組織變化 Ki-67免疫細胞化學(xué)染色見大部分腺泡細胞核呈棕褐色；個別導(dǎo)管細胞胞核呈褐色；對照組偶可見細胞核著色, 見圖2(A和B)。Amylase免疫細胞化學(xué)染色, IPR組導(dǎo)管細胞及導(dǎo)管附近細胞胞漿內(nèi)可陽性顆粒狀；對照組Amylase陽性顆粒主要位于腺泡細胞中,見圖2(C和D)。Ki-67與Amylase免疫細胞化學(xué)檢測時與對照組有較大差別。

圖1 下頜下腺HE染色

圖2 兩組SD大鼠下頜下腺組織免疫組化檢測

3 討論

Ki-67是在細胞周期除G0期和G1早期階段以外出現(xiàn)的核抗原, 其半衰期短, 能夠準確反映細胞的增殖活性, 廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)和臨床病理學(xué)檢測。5 d的IPR注射后,Ki-67標記的腺泡細胞明顯增加, 標記的閏管細胞也有所增多。以往的研究表明, 反復(fù)注射IPR能增強大鼠腮腺閏管細胞［4］和下頜下［5］腺體細胞的有絲分裂和肥大。作者的研究也現(xiàn)示, IPR注射能促使大鼠下頜下腺閏管細胞的增殖。在正常涎腺組織中, Amylase僅存在于腺泡細胞的分泌顆粒中,導(dǎo)管細胞, 包括閏管細胞均不表達Amylase。定量免疫組織化學(xué)分析顯示, IPR能導(dǎo)致腺泡細胞Amylase減少至正常值的10%, 停藥后能恢復(fù)至正常水平［6］。這有可能是IPR導(dǎo)致新形成的腺泡細胞過度分化所致。作者研究發(fā)現(xiàn), IPR注射5 d后, 腺泡細胞中幾乎很難見到Amylase陽性的分泌顆粒,而在閏管區(qū)的細胞中可以見到Amylase陽性的分泌顆粒。從形態(tài)特征上看, 這些細胞可能是閏管細胞分化為腺泡細胞的過渡細胞。此外, 這些過渡細胞出現(xiàn)在腺泡和閏管的交界處從另一個方面證實IPR注射后閏管細胞分化成腺泡細胞。Katsumata O［3］等發(fā)現(xiàn)連續(xù)5 d的IPR注射后, 腮腺腺泡細胞的總數(shù)增加了1.6倍, 而閏管細胞或小葉內(nèi)導(dǎo)管細胞的總數(shù)沒有增加也證實了這一點。

綜上所述, 本研究認為閏管細胞中存在能夠轉(zhuǎn)化為腺泡細胞的成體干細胞, 在發(fā)生大量的細胞死亡或強烈的刺激增殖, 如IPR的注射, 下頜下腺干細胞通過不對稱分裂, 開始表達這些潛在特性并分化為腺泡細胞。

［1］Riva A, Puxeddu R, Loy F, et al.Serous and mucous cells of human submandibular salivary gland stimulated in vitro by isoproterenol,carbachol and clozapine: an LM, TEM, and HRSEM Study.Eur J Morphol, 2003, 41(2): 83-87.

［2］Denny PC, Denny PA.DNA synthesis and cell division.In:Dobrosielski-Vergona K (ed) Biology of the salivary glands.CRC Press, Boca Raton, 1993:263-281.

［3］Katsumata O, Sato Y, Sakai Y, et al.Intercalated duct cells in the rat parotid gland may behave as tissue stem cells.Anat Sci Int, 2009,84(3): 148-154.

［4］Hand AR, Ho B.Mitosis and hypertrophy of intercalated duct cells and endothelial cells in the isoproterenol-treated rat parotid gland.J Dent Res, 1985, 64(8):1031-1038.

［5］Van den Brenk HA, Sparrow N, Moore V.Effect of X-ray irradiation on salivary gland growth in the rat.II.Quantitative studies on sialoadenotrophism induced with isopropylnoradrenaline and its modification by single doses of X-rays.Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med, 1970, 17(2):135-161.

［6］Vugman I, Hand AR.Quantitative immunocytochemical study of secretory protein expression in parotid glands of rats chronically treated with isoproterenol.Microsc Res Tech, 1995, 31(2):106-117.