王桂華 欒海云 馬春蕾 施 真 于臘梅

(濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東 煙臺 264003)

膽堿能系統(tǒng)在人類和實驗動物記憶功能中發(fā)揮重要作用，其功能減退可導(dǎo)致記憶力下降。研究發(fā)現(xiàn)，運動可促進動物海馬的神經(jīng)發(fā)生水平，增加突觸數(shù)量，加快長時程增強(LTP)的形成，從而提高動物的學(xué)習(xí)和記憶能力〔1〕。本實驗觀察運動對老年大鼠認知功能及大腦皮層和海馬組織乙酰膽堿酯酶(AchE)活性的影響，探討運動能否預(yù)防或減輕衰老引起的記憶功能減退及其可能機制。

1 材料與方法

1.1材料和儀器 Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究所)、曠場實驗箱(自制)，AchE試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1實驗動物及分組 雄性Wistar大鼠50只，由山東大學(xué)實驗動物中心提供〔SPF級，許可證號：SCXK(魯)20090001〕。飼養(yǎng)于濱州醫(yī)學(xué)院動物中心，溫度20℃±3℃，每天12 h光照，12 h黑暗，自由飲食，將其分為青年對照組(3月齡)、老年對照組(16月齡)、老年運動組(16月齡)：15 min/d游泳組、30 min/d游泳組、力竭游泳組，每組10只。運動條件〔2，3〕為80 cm×60 cm×40 cm立方形水體，水溫(25±1)℃，大鼠在水箱中游泳，四壁光滑且高出水面20 cm，無法借力及躍出。每次運動后，迅速用干毛巾擦干水分，電吹風(fēng)吹干后，放回籠中休息。力竭游泳組，反復(fù)力竭運動組每天1次力竭游泳運動，大鼠尾部負重體重的3%，每天1次，每周5 d，休息2 d，連續(xù)12 w，每次運動時間不少于2 h，力竭標(biāo)準(zhǔn)，即大鼠連續(xù)沉入水中超過10 s，撈出后置于平面不能完成翻正反射。對照組動物安靜飼養(yǎng)12 w。

1.2.2曠場實驗 游泳運動12 w后，休息24 h后進行開場實驗。敞箱高40 cm，長、寬為80 cm，四壁及底面為黑色，底面用白線劃分為面積相等的25塊。每只動物測定1次，每次測定5 min。將大鼠置于敞箱底面的中心方格內(nèi)，以穿越底面的格數(shù)記錄為水平運動次數(shù)，測量大鼠的活動度，以后肢直立次數(shù)記錄為垂直運動次數(shù)，測量大鼠對新鮮環(huán)境的好奇程度。實驗室內(nèi)暗光、安靜，箱底打掃清凈、干燥。

1.2.3Morris水迷宮實驗 曠場實驗后8 h，進行水迷宮檢測，水池直徑為100 cm，高60 cm，水深42 cm，水溫(25±1)℃，站臺高度為40 cm，站臺頂端平面10 cm×10 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍參照物保持不變。訓(xùn)練4 d，第5天進行隱藏平臺獲得實驗，分析處理潛伏期，考察學(xué)習(xí)能力。第6天撤去平臺，進行空間搜索實驗，去除平臺并觀察2 min內(nèi)大鼠在中心區(qū)停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)，測試記憶能力。

1.2.4AchE活性檢測 行為學(xué)實驗后斷頭處死大鼠，冰上迅速分離全腦，分別取皮層和海馬，稱重后用相當(dāng)于組織質(zhì)量9倍的生理鹽水分別將皮層和海馬制成勻漿，4℃ 3 500 r/min(離心機半徑為16 cm)離心10 min，去上清液，進行AChE活性檢測，方法按照說明書進行。蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

2 結(jié) 果

2.1曠場實驗結(jié)果 見表1。運動前各組(除青年對照組外)大鼠水平、垂直活動數(shù)無明顯差異(P>0.05)。青年對照組和老年對照組大鼠12 w后水平、垂直活動較之前均有所減少，統(tǒng)計學(xué)并無顯著差異(P>0.05)，提示隨著月齡增加，大鼠活動逐漸減少。游泳運動訓(xùn)練12 w后，15、30 min/d游泳運動組大鼠水平、垂直活動與老年對照組大鼠相比，明顯增高(P<0.05或P<0.01)，而力竭游泳組大鼠水平、垂直活動數(shù)較老年對照組大鼠有所降低，但兩者組間比較無顯著性差異(P>0.05)，提示15、30 min/d游泳運動使老年大鼠活動增多，而力竭游泳運動使老年大鼠活動數(shù)和探究能力有所下降。

2.2水迷宮實驗結(jié)果 隱藏平臺獲得實驗中，與青年對照組比較，老年對照組逃避潛伏期增加(P<0.01)；15 min/d游泳和力竭游泳組潛伏期較老年對照組縮短，但無顯著差異(P>0.05)，而30 min/d游泳組逃避潛伏期較老年對照組明顯縮短(P<0.01)?？臻g搜索實驗中，與青年對照組比較， 老年對照組大鼠在中心區(qū)停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)明顯減少(P<0.01) 。與老年對照組相比，游泳運動各組中心區(qū)停留時間百分比和通過原平臺位置次數(shù)均有不同程度增加，尤以30 min/d游泳組增加明顯(P<0.05或P<0.01)，見表2。

2.3大腦皮層和海馬AchE活性及表達 與青年對照組比較，老年對照組大鼠大腦皮層和海馬AchE活性均明顯升高(P<0.01)；游泳運動訓(xùn)練后，老年大鼠皮層和海馬AchE活性均不同程度降低，以30 min/d游泳運動作用最為明顯(P<0.01)。見表3。

表1 大鼠曠場實驗水平運動和垂直運動得分

表2 大鼠水迷宮實驗隱蔽平臺搜索、空間搜索實驗結(jié)果

表3 各組大鼠大腦皮層和海馬組織AchE活性

3 討 論

腦易受衰老影響，腦衰老表現(xiàn)為認知功能低下和中樞膽堿能系統(tǒng)功能下降。Singh等〔4〕發(fā)現(xiàn)16月齡大鼠學(xué)習(xí)記憶功能降低，故本實驗選用16月齡大鼠作為研究對象，觀察不同負荷運動對其干預(yù)作用。Morris水迷宮主要用于測試實驗動物對空間位置感和方向感(空間定位)的學(xué)習(xí)記憶能力。從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶儲存的機制主要涉及邊緣系統(tǒng)(如海馬)以及大腦皮層相關(guān)腦區(qū)。水迷宮實驗表明，老年大鼠穿越平臺次數(shù)和原平臺象限停留時間明顯低于青年大鼠，說明老年大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能降低；中、小負荷運動可有效提高老大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。為排除衰老合并抑郁癥， 我們引入了抑郁癥動物模型的經(jīng)典篩選方法開場實驗排除了抑郁癥所致的思維遲鈍、行動遲緩、情緒低落對Morris水迷宮測試結(jié)果的影響，使行為學(xué)結(jié)果更具可靠性和科學(xué)性。

神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說認為：參與或影響學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)遞質(zhì)是多系統(tǒng)的，但大腦記憶功能強弱主要取決于大腦內(nèi)乙酰膽堿(Ach)水平。當(dāng)大腦內(nèi)Ach水平高時，記憶腦區(qū)神經(jīng)傳導(dǎo)功能就會增強，腦神經(jīng)之間信息傳遞速度加快，記憶能力增強〔5〕。膽堿酯酶可水解乙酰膽堿，生成乙酸和膽堿，終止神經(jīng)沖動傳遞，間接反映乙酰膽堿代謝。有研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠膽堿酯酶活性下降與記憶功能降低呈平行關(guān)系〔6〕，其活力直接反映該系統(tǒng)的功能狀態(tài)，因此，Ach水平的變化可通過其水解酶AchE的活性反映。本實驗結(jié)果顯示老年大鼠大腦皮層和海馬AchE活性增高導(dǎo)致Ach水平下降可造成空間學(xué)習(xí)記憶障礙。

運動對學(xué)習(xí)記憶的影響逐漸成為研究熱點。研究顯示，從不運動的老人通過步行運動，其思維能力如計劃、安排和工作記憶力都相對有所改善〔7，8〕。大量動物實驗也表明，運動有助于動物海馬等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)元的增殖、存活和分化，促進LTP的誘導(dǎo)，提高實驗動物的空間記憶和被動逃避記憶能力〔9，10〕。運動對老年大鼠認知和記憶功能的保護作用與運動的負荷有很大的相關(guān)性，實驗結(jié)果顯示，老年組大鼠較青年組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力功能明顯下降，適當(dāng)負荷運動可以提高老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，中負荷的運動效果最好；其次是小負荷運動，相對比較大負荷(力竭游泳)運動對老年大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力未見明顯提高，同時開場實驗結(jié)果顯示力竭游泳組老年大鼠表現(xiàn)一定程度的抑郁狀態(tài)。為進一步探索運動對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的改善機制，通過檢測大腦皮層和海馬膽堿酯酶活力以期證明適量運動改善了腦組織Ach的水平，從而達到了改善老年大鼠對空間學(xué)習(xí)記憶的影響。結(jié)果顯示，數(shù)天的不同負荷游泳運動能降低大腦皮層和海馬組織膽堿酯酶活力，以小和中等負荷運動作用效果明顯，大負荷運動效果并不理想， 可能大負荷運動使老年大鼠極度疲勞，處于應(yīng)激狀態(tài)，大量神經(jīng)遞質(zhì)釋放紊亂，影響情緒和認知功能，而起不到改善認知功能作用效果。實驗結(jié)果表明，在實踐中制定對老個體進行運動治療的方案時，要針對不同的個人情況選擇個性化運動方案，只有適當(dāng)?shù)倪\動才可以獲得最好的效果。

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