楊鳳真 王 芳 周 麗 黃利華 周 軍 李聞文

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013)

近年來對(duì)褪黑素(MLT)和衰老的相關(guān)性研究受到關(guān)注，隨著年齡的增長(zhǎng)MLT水平及其分泌節(jié)律性降低，使衰老的機(jī)體易于發(fā)生疾病〔1，2〕。而外源性應(yīng)用MLT可以延長(zhǎng)壽命，推遲衰老〔3〕。本實(shí)驗(yàn)研究MLT對(duì)不同年齡小鼠腦組織細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)表達(dá)的影響，探討MLT與年齡相關(guān)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組與模型制備 雄性B6C3F1小鼠，為C57BL/6和C3H的雜交品種，5.5月齡(年輕組)20只，10只為年輕對(duì)照組(YC)， 10只為年輕MLT處理組(YM)；26月齡(老年組)20只，10只為老年對(duì)照組(OC)，10只為老年MLT處理組(OM)，4組小鼠均2個(gè)或4個(gè)一籠飼養(yǎng)在溫控室(22±1)℃，并給予12 h的日光與暗室循環(huán)交替。動(dòng)物隨意攝取食物和水，YC和OC組小鼠均給予基礎(chǔ)飼料，由10%蔗糖、14%干酪素和少量的鹽、維生素混合而成。而YM和OM組則給予含有0.04 mg/kg MLT的基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，所有動(dòng)物連續(xù)喂養(yǎng)2.5個(gè)月。

1.2腦組織切片標(biāo)本制備 2.5個(gè)月后取各組小鼠腦組織，先以0.1%戊巴比妥鈉(150 mg/kg)深度麻醉小鼠，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注生理鹽水，待小鼠肝臟顏色變淺后，取出腦組織，取出的腦組織分為兩半，一半置于-80℃冰箱備用， 另一半固定于新鮮配制的4%多聚甲醛溶液中4℃冰箱過夜，次日以0.01 mol/L的磷酸緩沖液(PBS)反復(fù)浸洗，最后將腦組織梯度酒精脫水、透明、石蠟包埋、冠狀切片(厚約5 μm)備用。

1.3免疫組織化學(xué)方法 脫蠟后的切片入PBS，經(jīng)抗原修復(fù)液(美國Vector, H-3300)在80%水浴箱內(nèi)修復(fù)20 min, 切片自然冷卻后PBS浸洗2次, 每次5 min，再入3%H2O2室溫反應(yīng)5 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，經(jīng)PBS洗滌后，切片孵育在2%小牛血清中1 h以減少非特異性反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)中所用一抗ERK購自美國Santa Cruz公司，PDI購自Assay Designs公司。切片在ERK(1∶100)和PDI(1∶500)抗體中4℃冰箱孵育過夜，所用一抗均由1.5%羊血清、0.15%Triton X100和0.01 mol/L PBS配制，次日一抗經(jīng)PBS洗滌3次后, 加入相應(yīng)二抗(1∶400)，室溫孵育2 h，PBS洗滌，然后在以生物素與卵白素結(jié)合(ABC)配制的混合液中孵育2 h。底物呈色反應(yīng)采用DAB試劑盒，顯微鏡下觀察陽性反應(yīng)程度，DAB顯色時(shí)間約為3～5 min。 免疫組化過程中所使用的二抗、ABC和DAB試劑盒均購自美國Vector公司。呈色反應(yīng)后，切片經(jīng)酒精逐級(jí)脫水和二甲苯透明后采用加拿大中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4數(shù)據(jù)采集 上述免疫組織化學(xué)反應(yīng)的切片在日本Nikon Eclipse 80i熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，用Nikon DS高分辨率數(shù)碼相機(jī)經(jīng)NIS-Elements AR 3.0軟件(1 280×1 024 pixel)對(duì)腦組織切片拍照收集腦皮質(zhì)與海馬等部位切面圖像。數(shù)字化的圖像則由Ver.3.00程序軟件作半定量分析(陽性染色區(qū)域百分比取每張切片的5個(gè)不連續(xù)高倍鏡視野的平均值)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少2次，每組統(tǒng)計(jì)動(dòng)物數(shù)在8個(gè)以上。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1ERK的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 ERK在各組小鼠腦組織均有不同程度表達(dá)，分布較為廣泛，陽性產(chǎn)物見于神經(jīng)元的胞質(zhì)、胞核和突起。年輕組小鼠(YC、YM)腦組織的ERK反應(yīng)均較強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量較老年組多(P<0.05)，細(xì)胞染色較深，YC和YM組ERK陽性反應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，YM組陽性細(xì)胞數(shù)多于YC組。ERK在老年組腦組織海馬和皮質(zhì)部位均有表達(dá)，但老年組ERK反應(yīng)明顯減弱，陽性細(xì)胞數(shù)量減少，OC組僅見少量陽性反應(yīng)，OM組ERK陽性反應(yīng)較OC組強(qiáng)(P<0.05)。見圖1。

2.2PDI的免疫組化檢測(cè)結(jié)果 PDI表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)，顯微鏡下陽性反應(yīng)呈棕黃色。YC和YM組PDI表達(dá)較強(qiáng)，細(xì)胞染色較深且細(xì)胞體積較大，YM組陽性細(xì)胞數(shù)多于YC組(P<0.05)。OC和OM組陽性細(xì)胞數(shù)較少，細(xì)胞體積較小，以O(shè)C組陽性細(xì)胞數(shù)量最少，與OM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

箭頭示陽性細(xì)胞，下圖同

圖2 PDI在各組小鼠腦組織內(nèi)的表達(dá)(×400)

2.3ERK和PDI的半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果 年輕組小鼠ERK和PDI的表達(dá)量多于老年組(P<0.05)。MLT可以增加小鼠腦內(nèi)ERK和PDI的表達(dá)(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠ERK和PDI表達(dá)的半定量統(tǒng)計(jì)表

3 討 論

MLT是松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其化學(xué)名稱是5-甲氧基-N-乙?；?，1958年由Lerner及其同事首次從牛的松果腺中分離并鑒定〔4，5〕。MLT的血漿水平隨著年齡增長(zhǎng)而發(fā)生相應(yīng)變化，在幼兒期保持高水平，青春發(fā)育期開始下降，而后其水平在成年期保持恒定，直到老年期明顯下降。大量研究〔6，7〕證明，MLT具有明顯的抗衰老作用。外源性應(yīng)用MLT可以推遲衰老〔8〕。

目前許多實(shí)驗(yàn)〔9，10〕都證明了MLT強(qiáng)大的抗氧化作用，主要通過3個(gè)方面：一是直接與自由基結(jié)合，MLT是羥基的強(qiáng)消除劑，其消除能力是谷胱甘肽的4倍；二是減少體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，如MLT可以抑制NO合酶的活性，抑制NO的生成；三是提高體內(nèi)抗氧化酶的活性。另外，MLT具有親脂性和親水性的雙極性分子特征，可以進(jìn)入任何亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和體液中，發(fā)揮抗氧化作用，從而有效地減少細(xì)胞凋亡〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MLT通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的活性，促進(jìn)腦組織新陳代謝，起到保護(hù)腦組織、延緩衰老的作用。

ERK分為ERK1和ERK2，是90年代初期先后被分離鑒定的一種蛋白激酶，它們有90%的同源性。ERK為脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸 /蘇氨酸激酶，可以使脯氨酸相鄰的絲氨酸 /蘇氨酸磷酸化。靜止?fàn)顟B(tài)下ERK定位于胞質(zhì)，當(dāng)其激活后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞效應(yīng)。ERK可以活化抗凋亡分子同時(shí)刺激表達(dá)存活相關(guān)基因從而產(chǎn)生抗凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示MLT可能通過增加ERK的活性來減少腦組織的凋亡反應(yīng)。

PDI廣泛存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔中，是蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，又是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶家族重要成員。作為折疊酶PDI可催化蛋白質(zhì)分子中二硫鍵的形成，作為分子伴侶PDI在蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要的作用。PDI可以識(shí)別未折疊或部分折疊的新生肽折疊中間物的非天然結(jié)構(gòu)，或變性蛋白在重折疊過程中形成的折疊中間物的非天然結(jié)構(gòu)，通過其多肽結(jié)合部位與之結(jié)合，防止靶蛋白或底物蛋白之間錯(cuò)誤的結(jié)合和聚合〔12〕。衰老的機(jī)體PDI合成減少，異常折疊蛋白質(zhì)增多，更易于發(fā)生疾病、加速衰老。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MLT能夠增加年輕組與年老組PDI的表達(dá)，減少錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的形成，從而有效延緩機(jī)體衰老。

MLT除了具有清除自由基、抗氧化、抗應(yīng)激、抑制凋亡與延緩衰老等生物學(xué)作用外，尚有增強(qiáng)免疫、校準(zhǔn)生物鐘〔13〕、抑制腫瘤生長(zhǎng)〔14〕和調(diào)節(jié)其他內(nèi)分泌的作用。因此，MLT的應(yīng)用前景非常廣闊，有望臨床常規(guī)應(yīng)用于預(yù)防與治療神經(jīng)退化性疾病及其他年齡相關(guān)疾病。

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