李鴻博 郎小娥

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京 100005)

及時(shí)開(kāi)通梗死相關(guān)動(dòng)脈恢復(fù)心肌血流灌注，挽救瀕死心肌是治療急性心肌梗死最有效最關(guān)鍵的措施。然而缺血心肌的再灌注(I/R)可引起心肌I/R損傷(MIRI)。隨著心臟外科手術(shù)和介入治療技術(shù)的進(jìn)展以及心肌缺血病人的增加，MIRI已成為臨床上常見(jiàn)的一種病理生理過(guò)程。隨著研究的深入，缺血預(yù)處理、麻醉預(yù)處理等一系列心肌保護(hù)措施已被發(fā)現(xiàn)〔1～3〕，且已被證明可以有效地對(duì)抗MIRI。心臟保護(hù)的機(jī)制較為復(fù)雜，其中乙醛脫氫酶2(ALDH2)的磷酸化與激活被證明在心臟保護(hù)中起關(guān)鍵介導(dǎo)作用〔4〕。另外，有研究發(fā)現(xiàn)在再灌注初期蛋白激酶Cδ(PKCδ)活化可通過(guò)調(diào)控線粒體介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡和壞死，抑制PKCδ則會(huì)減輕I/R的各項(xiàng)損傷指標(biāo)〔5〕。粗糠柴毒素是從植物粗糠柴中提取出的一種小分子物質(zhì)〔6〕。Gschwendt等〔7〕首次報(bào)道粗糠柴毒素是一種PKCδ的選擇性抑制劑后，大量實(shí)驗(yàn)研究以施用粗糠柴毒素作為抑制PKCδ活性的藥理學(xué)手段。另一方面，關(guān)于粗糠柴毒素的潛在藥物用途的研究也有報(bào)道，但就其對(duì)抗MIRI的效果卻研究較少。本研究通過(guò)構(gòu)建大鼠在體心肌I/R模型并觀察粗糠柴毒素的處理效果來(lái)闡明粗糠柴毒素的心臟保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性SD大鼠，體重200～220 g。由清華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。安置于無(wú)特殊病原體、溫度(23℃±3℃)和濕度(60%±5%)的控制室內(nèi)，光暗周期為12 h：12 h(光照早上8點(diǎn)開(kāi)始)。飲用水和標(biāo)準(zhǔn)飼料均經(jīng)滅菌后供動(dòng)物自由取用。

1.2急性心肌I/R模型制備 給予實(shí)驗(yàn)SD雄性大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，氣管切開(kāi)術(shù)后，大鼠肺組織進(jìn)行機(jī)械正壓通氣，使用30%～40%的空氣/氧氣混合物，通過(guò)調(diào)整呼吸頻率和潮氣量，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中維持動(dòng)脈血?dú)鈖H值在生理范圍內(nèi)。心肌梗死是由結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)引起。在大鼠胸骨左緣第4或第5肋間隙開(kāi)胸，實(shí)施胸廓切開(kāi)術(shù)及心包切開(kāi)術(shù)后，暴露心臟，在距LAD基部2～3 mm處用6～0無(wú)創(chuàng)傷性絲線進(jìn)行結(jié)扎，通過(guò)結(jié)扎LAD造成心肌梗死即可建立大鼠急性心肌缺血模型。剪斷結(jié)扎線心肌復(fù)灌。對(duì)所有大鼠進(jìn)行區(qū)域性心肌缺血40 min，之后進(jìn)行120 min再灌注處理〔8〕。將大鼠隨機(jī)分為兩組，各8只：實(shí)驗(yàn)組在缺血處理前5 min給予1 μmol/L粗糠柴毒素處理，對(duì)照組以生理鹽水處理。

1.3血清乳酸脫氫酶(LDH)活性和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性的測(cè)定 再灌注5 min后，從各實(shí)驗(yàn)組大鼠采集5 ml靜脈血樣本，使用臺(tái)式離心機(jī)以5 000 r/min離心5 min，血清保存于液氮中。樣品解凍后進(jìn)行分析測(cè)定。使用7 600全自動(dòng)生化分析儀及商用試劑盒Creatine Kinase-MB Liquid Reagent和Cytotoxicity Detection Kit (LDH) 測(cè)定LDH和CK-MB的活性，作為評(píng)價(jià)心肌損傷的指標(biāo)。

1.4Western 印跡測(cè)定心肌組織phos-ALDH2和Total-ALDH2蛋白的表達(dá) 取血后，迅速剪下各組大鼠的心臟，每只大鼠取相同部位的左心室前壁心肌組織0.2 g，用生理鹽水沖洗，剪碎心肌組織后加入2 ml RIPA裂解液(1 ml RIPA+10 μl PMSF)至玻璃勻漿器中，冰浴下進(jìn)行機(jī)械勻漿，勻漿液在冰上靜置30 min直至充分裂解后，以12 000 r/min 4℃離心30 min，取上清，用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用RIPA裂解液均衡每一樣品中的蛋白液濃度，保證每個(gè)樣品孔蛋白上樣量一致，加入5×loading buffer后，于100℃煮沸變性5 min，分裝蛋白上樣液并于-70℃儲(chǔ)存。取50 μg蛋白上樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電泳分離蛋白后，將目標(biāo)蛋白帶轉(zhuǎn)移至聚偏氯乙烯(PVDF)膜上，將印跡后的PVDF膜放入盛有封膜液的平皿中室溫孵育封閉2 h。用抗體稀釋液按1∶1 000分別稀釋兔抗大鼠ALDH2抗體和兔抗大鼠Phos-ALDH2抗體，按1∶500稀釋抗大鼠β-actin抗體，將PVDF膜蛋白面朝下放于抗體液面上，4℃孵育過(guò)夜。用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌PVDF膜3次，5 min/次。然后將膜用TBST(1∶2 000)稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫下孵育2 h后，用TBST室溫下洗膜3次，10 min/次。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值等記錄相應(yīng)的表達(dá)量，得出磷酸化ALDH2占總ALDH2的比例。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS15.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

粗糠柴毒素處理顯著抑制大鼠MIRI所導(dǎo)致的血清CK-MB和LDH升高。另外，粗糠柴毒素處理使I/R心肌細(xì)胞ALDH2磷酸化水平顯著增加，這提示粗糠柴毒素可能通過(guò)激活A(yù)LDH2來(lái)誘導(dǎo)心臟保護(hù)。各組LDH、CK-MB活性及ALDH2磷酸化比例見(jiàn)表1。典型的Western 印跡條帶，見(jiàn)圖1。

表1 兩組LDH、CK-MB活性與phos-ALDH2/Total-ALDH2比值比較

圖1 Western 印跡結(jié)果

3 討 論

自從1994年粗糠柴毒素被首次報(bào)道以來(lái)，關(guān)于粗糠柴毒素藥理作用的研究一直在進(jìn)行〔7〕。目前已發(fā)現(xiàn)的作用包括抗過(guò)敏、誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞自噬及凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等〔8～11〕。也有文獻(xiàn)報(bào)道〔6〕粗糠柴毒素有希望作為新的腫瘤化療藥物。

關(guān)于粗糠柴毒素的作用機(jī)制至今尚存在爭(zhēng)議。最初認(rèn)為粗糠柴毒素是一種選擇性的PKCδ抑制劑〔7〕，并用于大量對(duì)PKCδ生物學(xué)功能的研究中〔6〕。然而，隨后有證據(jù)表明在很多條件下粗糠柴毒素對(duì)PKCδ活性并無(wú)直接影響，而且特異性不強(qiáng)，對(duì)蛋白激酶家族的多個(gè)成員如PKB、PRAK等均具有抑制作用〔12〕。也有研究表明在PKCδ敲除的大鼠中，粗糠柴毒素還可表現(xiàn)其抑制蛋白磷酸化的作用〔13〕。目前一般認(rèn)為粗糠柴毒素的作用機(jī)制復(fù)雜，存在PKCδ依賴(lài)和非PKCδ依賴(lài)兩類(lèi)途徑〔6〕。粗糠柴毒素的線粒體氧化磷酸化解耦聯(lián)作用已被證明不依賴(lài)于PKCδ，其下游事件可能是粗糠柴毒素多種生物學(xué)功能的真正機(jī)制〔14〕。

粗糠柴毒素與細(xì)胞凋亡的關(guān)系也較為復(fù)雜。研究證實(shí)粗糠柴毒素有促凋亡與抑制凋亡的雙重作用，且可能為PKCδ依賴(lài)或非PKCδ依賴(lài)性〔14〕。已有研究〔10〕表明粗糠柴毒素具有胰腺腫瘤干細(xì)胞凋亡的作用，而本研究中粗糠柴毒素表現(xiàn)為抑制I/R心肌細(xì)胞的凋亡及物質(zhì)釋放。ALDH2作為一種醛類(lèi)代謝的關(guān)鍵酶，在清除缺氧條件下產(chǎn)生的毒性醛類(lèi)起關(guān)鍵作用，其磷酸化參與了多種藥物預(yù)處理方式如乙醇預(yù)處理〔5〕、麻醉預(yù)處理〔15〕等誘導(dǎo)的心臟保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)提示了無(wú)論粗糠柴毒素在對(duì)抗MIRI方面的機(jī)制如何，這一物質(zhì)最終能夠激活A(yù)LDH2保護(hù)通路，減輕I/R引起的心肌細(xì)胞死亡。雖然粗糠柴毒素尚未被批準(zhǔn)藥用〔16〕，且其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明，然而本研究提示了一種新的藥物預(yù)處理方式，對(duì)MIRI的機(jī)制研究提供了新的途徑。

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