臧金鋒 袁 寅 高軍業(yè) 錢海鑫

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，江蘇 蘇州 215006)

c-Met是原癌基因，編碼肝細(xì)胞生長因子受體(HGFR)。c-Met正常表達(dá)于胚胎時(shí)期或者成人時(shí)期的許多器官內(nèi)，通過與配體HGF結(jié)合，激活多條細(xì)胞內(nèi)信號通路，影響細(xì)胞的增殖、移行和分化?；蚯贸龑?shí)驗(yàn)證明，HGF/c-Met系統(tǒng)在胚胎存活和胎肝發(fā)育過程中是必需的〔1,2〕。在大鼠AAF/PH模型中，卵圓細(xì)胞的激活和增殖早期也有HGF/c-Met參與〔3〕。通過對肝臟再生模型的研究發(fā)現(xiàn)，c-Met的缺乏將導(dǎo)致肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解平衡失調(diào)，最終損害肝臟的再生能力〔4〕。HGF/c-Met相關(guān)的下游信號通路對大鼠肝臟祖細(xì)胞增殖的影響尚未有詳細(xì)報(bào)道。本研究觀察選擇性c-Met 磷酸化抑制劑Su11274對原代培養(yǎng)大鼠肝臟祖細(xì)胞的影響，并分析PI3K/AKT和STAT3信號通路在其中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級Wistar大鼠30只，均為雄性，4周齡，平均體重(200±10)g，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室要求正常投喂飼料。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2主要試劑 CD90.1 MicroBeads及MACS分選裝置(Miltenyi)； EGF、HGF、Su11274、DMEM、胎牛血清、Ⅳ型膠原酶、特級胎牛血清(FBS)、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、煙酰胺、胰島素、地塞米松、青霉素、鏈霉素(Sigma，美國)；Western印跡一抗為兔抗大鼠c-Met、PI3K、AKT、STAT3，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Santa Cruz，美國)，其他所用試劑購自Sigma公司，PVDF膜購自Millipore公司。

1.3肝臟祖細(xì)胞的分選和培養(yǎng) 正常大鼠肝臟經(jīng)兩步灌洗〔4〕后游離取出，剔除肝門的結(jié)締組織和包膜，用剪刀銳性分離肝臟組織后振蕩，游離的細(xì)胞脫落到緩沖液中。細(xì)胞懸液經(jīng)100目濾網(wǎng)過濾，濾液4℃離心5 min，收集上清液，于4℃離心5 min，棄上清，所得沉淀為肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。PBS重懸細(xì)胞。MACS分選CD90.1+細(xì)胞(嚴(yán)格按操作說明操作)，流式細(xì)胞儀檢測CD90.1+細(xì)胞百分率>98%。

1.4肝祖細(xì)胞培養(yǎng) 收集MACS分選所得CD90.1+細(xì)胞，對照組用DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，100 U/ml青、鏈霉素，1%胰島素，50 ng/ml HGF，20 ng/ml EGF)懸浮于96孔培養(yǎng)板，置37℃、5%CO2細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)，24 h后換液，去除懸浮細(xì)胞和雜質(zhì)，以后根據(jù)細(xì)胞生長狀況和培養(yǎng)基顏色換液。實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)液中加入Su11274，預(yù)實(shí)驗(yàn)提示有效工作濃度為2 μmol/L。

1.5MTT比色法檢測細(xì)胞增殖 在觀測時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10 μl 5 mg/ml MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇490 nm波長，以含MTT、二甲基亞砜的培養(yǎng)液調(diào)零，測定各孔光吸收值A(chǔ)490，每個(gè)檢測點(diǎn)取三孔平均值。

1.6Western印跡法檢測蛋白表達(dá) 按觀測時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白， BCA法測定蛋白濃度。取總蛋白50 μg，依次進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜、封閉之后，采用一抗兔抗大鼠c-Met、p-c-Met、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、STAT3、p-STAT3，4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。封閉液稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG抗體(1∶1 000)孵育2～3 h。孵育結(jié)束后TBST洗膜3次，每次5 min，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、顯影和圖像分析。以所測蛋白與內(nèi)參α-actin灰度的比值反映其表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1Su11274對肝臟祖細(xì)胞的抑制作用 2 μmol/L Su11274抑制率為2 d 4.35%，4 d 7.69%，6 d 11.11%，8 d 9.38%，10 d 16.67%，12 d 16.28%，14 d 15.91%，抑制作用的最強(qiáng)時(shí)間點(diǎn)在10～14 d。

2.2肝臟祖細(xì)胞 c-Met蛋白表達(dá)及磷酸化比值 對照組肝臟祖細(xì)胞c-Met蛋白持續(xù)陽性表達(dá)，在培養(yǎng)第6天c-Met蛋白表達(dá)水平增加至1.25±0.29，第8、10、12、14天分別為1.56±0.22、1.59±0.30、1.61±0.27、1.60±0.28。實(shí)驗(yàn)組p-c-Met蛋白水平也從第6天開始增加，第6、8、10、12、14天分別為0.82±0.25、1.16±0.27、1.15±0.24、1.15±0.29、1.16±0.22，Su11274作用后c-Met蛋白與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.71)；而p-c-Met蛋白在培養(yǎng)第8天開始出現(xiàn)明顯下降，而且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長p-c-Met蛋白下降愈加明顯，第8、10、12、14天分別為0.45±0.12、0.36±0.10、0.22±0.08、0.13±0.03，與對照組相比明顯下調(diào)(P=0.026)。對照組p-c-Met/c-Met比值始終保持在0.7左右，實(shí)驗(yàn)組磷酸化比值明顯下降，提示Su11274可以有效抑制c-Met磷酸化。見表1。

表1 對照組和實(shí)驗(yàn)組肝臟祖細(xì)胞p-c-Met/c-Met比值

2.3肝臟祖細(xì)胞PI3K、AKT蛋白表達(dá)及磷酸比值 對照組PI3K、AKT蛋白表達(dá)基本穩(wěn)定。使用Su11274后，實(shí)驗(yàn)組肝臟祖細(xì)胞PI3K 、AKT蛋白表達(dá)無明顯變化(P=0.65，P=0.73)。Su11274作用后，實(shí)驗(yàn)組p-PI3K蛋白第10天開始下降，第10、12、14天分別為1.36±0.14、1.28±0.15、1.14±0.14(P=0.033)；同樣，實(shí)驗(yàn)組p-AKT蛋白第10天開始下降，第10、12、14天分別為0.36±0.11、0.31±0.09、0.22±0.11(P=0.014)。對照組p-PI3K/ PI3K、p-AKT/AKT比值穩(wěn)定在0.8和0.5左右，實(shí)驗(yàn)組p-PI3K/PI3K磷酸化比值第10天開始下降，實(shí)驗(yàn)組p-AKT/AKT磷酸化比值也從第10天開始下降。見圖1、圖2。

圖1 兩組肝臟祖細(xì)胞p-PI3K、 PI3K、p-AKT、AKT、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值、p-STAT3/STAT3比值比較

圖2 實(shí)驗(yàn)組肝臟祖細(xì)胞STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)

2.4肝臟祖細(xì)胞STAT3蛋白磷酸化水平的影響 對照組肝臟祖細(xì)胞STAT3蛋白表達(dá)在第6天后開始下降至0.53±0.14，在第10天下降至0.43±0.12，以后基本維持穩(wěn)定，第12、14天分別為0.42±0.10、0.43±0.11。實(shí)驗(yàn)組STAT3蛋白表達(dá)在第6、10、12、14天分別為0.52±0.13、0.42±0.09、0.40±0.12、0.41±0.10，與對照組變化相似(P=0.73)。對照組p-STAT3從第6天后開始下降，第6、8、10、12、14天分別為0.22±0.11、0.18±0.06、0.13±0.05、0.13±0.07、0.13±0.05；實(shí)驗(yàn)組p-STAT3也從第6天后開始下降，第6、8、10、12、14天分別為0.22±0.08、0.17±0.05、0.15±0.05、0.11±0.07、0.06±0.02，下降幅度大于對照組(P<0.001)。對照組p-STAT3/STAT3磷酸化比值在第6天降至0.41±0.06，第8、10、12、14天分別為0.37±0.04、0.30±0.04、0.31±0.03、0.30±0.05。實(shí)驗(yàn)組p-STAT3/STAT3磷酸化比值在第6天降至0.42±0.07，第8、10、12、14天分別為0.36±0.04、0.35±0.09、0.28±0.07、0.15±0.03。見圖1、圖2。

3 討 論

c-Met表達(dá)于肝臟、腎臟、胰腺、骨髓等多種器官的上皮細(xì)胞表面，與以旁分泌形式產(chǎn)生的HGF結(jié)合后激活胞漿內(nèi)多條下游信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)正常細(xì)胞的再生、遷移以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、新生血管形成等多種生理和病理反應(yīng)，HGF/c-Met信號通路廣泛參與組織的再生、修復(fù)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展〔5～7〕，已經(jīng)成為研究器官發(fā)育、組織修復(fù)和腫瘤治療的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中，原代培養(yǎng)的正常肝臟祖細(xì)胞內(nèi)c-Met蛋白持續(xù)陽性表達(dá)，從培養(yǎng)的第6天開始上升，其后一直處于高水平表達(dá)狀態(tài)，提示c-Met對于肝臟祖細(xì)胞的增殖可能發(fā)揮重要作用。HGF/c-Met信號通路被激活后，可以聚集許多效應(yīng)分子，激活下游相應(yīng)的信號傳導(dǎo)通路，從而啟動(dòng)一系列的生物學(xué)效應(yīng)。在磷酸化的狀態(tài)下，c-Met的主要激酶位點(diǎn)有兩個(gè)，各自發(fā)揮不同的作用：①通過CBL結(jié)合到酪氨酸激酶催化區(qū)，產(chǎn)生泛素化酶，發(fā)揮下調(diào)c-Met受體及下游受體酪氨酸激酶活性的作用，即HGF-c-Met-CBL通路的負(fù)性調(diào)節(jié)作用〔8,9〕；②Met尾端存在的多功能激酶位點(diǎn)，能夠與含有SH2結(jié)構(gòu)域的許多效應(yīng)分子結(jié)合，例如生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)、PI3K、STAT3、接頭蛋白GAB1、SRC等，發(fā)揮對應(yīng)通路的相關(guān)作用。

PI3K是與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)相關(guān)的脂類第二信使信號，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性，參與調(diào)節(jié)代謝、細(xì)胞凋亡和生存，異?；罨腜I3K在許多腫瘤得到證實(shí)〔10〕。在PI3K催化下，細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇3，4二磷酸(PIP2)進(jìn)行磷酸化，生成磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸(PIP3)。PIP3是一個(gè)強(qiáng)烈的信號分子，可以募集并調(diào)節(jié)下游的一系列效應(yīng)因子，AKT是其中最重要的因子。mTOR是AKT參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的一個(gè)下游因子〔11〕。Okano等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)大鼠卵圓細(xì)胞時(shí)使用AKT抑制劑后，HGF引起的細(xì)胞增殖受到阻滯，表明PI3K/AKT參與HGF刺激肝卵圓細(xì)胞增殖過程。肝臟祖細(xì)胞在向膽管細(xì)胞分化過程中同樣需要PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路，Tanimizu等〔13〕觀察肝臟祖細(xì)胞分化形成膽管時(shí)，PI3K、AKT兩者的抑制劑均可減少膽管結(jié)構(gòu)的生成，證實(shí)PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路是體外培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)形成膽管結(jié)構(gòu)所必需的信息傳遞系統(tǒng)；通過對胎肝進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)AKT和磷酸化的AKT在發(fā)育至第18天的胎肝中有明顯表達(dá)，免疫熒光檢測磷酸化的AKT表達(dá)于肝小葉的匯管區(qū)。Magner等〔14〕研究胚胎干細(xì)胞向內(nèi)胚層細(xì)胞、肝臟祖細(xì)胞和肝細(xì)胞定向分化過程時(shí)發(fā)現(xiàn)，胰島素和胰島素樣生長因子可以增加干細(xì)胞的定向分化能力，抑制PI3K/AKT通路或胰島素樣生長因子受體可以明顯削弱向肝細(xì)胞的分化能力，PI3K還可以通過上調(diào)HNF1、HNF4的表達(dá)調(diào)節(jié)內(nèi)胚層細(xì)胞的分化能力，可見PI3K在干細(xì)胞分化為肝細(xì)胞的過程中有著非常重要的作用，且不同的分化階段，下游的相關(guān)信號傳導(dǎo)機(jī)制可能有所不同。AKT同樣可以通過下游的其他信號傳遞因子，對胚胎和腫瘤干細(xì)胞的生長發(fā)揮調(diào)節(jié)功能〔15〕。

STAT3被認(rèn)為是肝臟再生的觸發(fā)因素之一。Hosoya等〔16〕證實(shí)NK和NKT細(xì)胞可通過TNF-α、STAT3和HGF促進(jìn)肝切除后的殘肝再生能力，表明STAT3是炎癥因子調(diào)控肝臟再生的一個(gè)中繼信號通路?，F(xiàn)已證實(shí)，IL-6/STAT3信號通路參與肝臟的再生修復(fù)，該通路包括IL-6受體、gp130、 JAK (受體相關(guān)Janus激酶)和STAT3。JAK具有磷酸化酶活性，可以激活gp130和STAT3〔17〕。在肝臟再生中，STAT3主要發(fā)揮促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用，在小鼠STAT3基因缺失模型中，肝切除后肝細(xì)胞DNA合成能力減弱、有絲分裂活動(dòng)也明顯減少，72 h內(nèi)與G1期相關(guān)的cyclinD1、cyclinE的表達(dá)也隨之顯著下降〔18〕。肝臟再生過程中，細(xì)胞的增殖受到細(xì)胞周期素的精確調(diào)控，STAT3 通過控制cyclinD1的表達(dá)來調(diào)節(jié)細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，允許細(xì)胞跨越G1期，進(jìn)入S期，最終轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋称诩?xì)胞〔19〕。Lai等〔20〕發(fā)現(xiàn)，在肝切除再生模型中，IL-6水平與血管緊張素原表達(dá)呈正比，并通過JAK/STAT3、JAK/p38/NF-κB通路參與缺血再灌注損傷。肝臟祖細(xì)胞STAT3蛋白于第6天開始下調(diào)，c-Met磷酸化被抑制后，STAT3蛋白的磷酸化水平也有所下降。

本實(shí)驗(yàn)表明肝臟祖細(xì)胞表達(dá)c-Met，在c-Met磷酸化抑制后，肝臟祖細(xì)胞增殖受到抑制，PI3K/AKT、STAT3磷酸化也下降，提示在肝臟祖細(xì)胞的增殖階段PI3K/AKT、STAT3可能是HGF/c-Met的相關(guān)下游信號，該結(jié)果為進(jìn)一步研究肝臟祖細(xì)胞的生長調(diào)控提供了理論依據(jù)。

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