王 爽 于洪泉 溫 娜 紀鵬艷 金 宏 王瑋瑤 曹志友

(吉林醫(yī)藥學院醫(yī)學實驗中心，吉林 吉林 132013)

肺癌的發(fā)生與多種致病因素有關，化療在肺癌的治療中始終占有重要的地位。但由于化療藥物用量大，副作用多，很多患者難以忍受?，F(xiàn)代中藥研究表明，很多中藥成分都具有抗腫瘤作用，因此，人們對中藥抗腫瘤的研究越來越多。核桃青皮是民間密方白桃湯劑中的主要成分，故本實驗擬研究核桃青皮提取物誘導Lewis肺癌細胞凋亡的作用，為該藥抗腫瘤作用提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，小牛血清和胰蛋白酶(Gibco公司)，核桃青皮粉劑(吉林醫(yī)藥學院自制)，四甲基偶氮唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和順鉑(美國Sigma公司)。

1.2Lewis肺癌細胞的培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的Lewis肺癌細胞，37℃水浴振蕩至融解，然后將細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10 ml含10%小牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)液，將其置入37℃、5%CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔日換液。

1.3MTT法檢測藥物對Lewis肺癌細胞的誘導凋亡作用 稱取適量核桃青皮提取物，加入含5%小牛血清RPMI-1640細胞培養(yǎng)液，配制成終濃度為0、1、2和4 μg/L的含藥培養(yǎng)基。將細胞制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為8×104/ml，將96孔板加入細胞懸液，每孔100 μl，置入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入含藥培養(yǎng)基，每個藥物濃度重復5次。分別于30 min、3、12、24 h終止反應，每孔加入MTT 20 μl，37℃孵育4 h，棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，搖床震蕩均勻使MTT沉淀完全溶解，15 min后在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長處測定各孔吸光度(A)值，用不加細胞的空白孔調(diào)零。

2 結 果

2.1不同濃度核桃青皮提取物對Lewis肺癌細胞的誘導凋亡作用 核桃青皮提取物在作用Lewis肺癌細胞30 min、3 h、12 h和24 h，主要表現(xiàn)為對細胞的誘導凋亡作用。30 min時各藥物濃度組細胞生長并未表現(xiàn)出明顯的作用；3 h時各藥物濃度組細胞凋亡開始出現(xiàn)，以4 μg/L濃度組最明顯，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；12 h時各藥物濃度組細胞凋亡2和4 μg/L濃度組最明顯，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)；24 h時各藥物濃度組細胞凋亡在1、2和4 μg/L濃度組明顯，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.001)。見圖1。

2.2核桃青皮提取物聯(lián)合順鉑對Lewis肺癌細胞的誘導凋亡作用 0、1、2和4 μg/L核桃青皮提取物聯(lián)合順鉑作用Lewis肺癌細胞24 h，聯(lián)合用藥組細胞均明顯發(fā)生凋亡；與單獨應用核桃青皮提取物組比較，2、4 μg/L濃度組細胞凋亡更加明顯(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

與0 μg/L組比較：1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001

與未加順鉑組相比：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

自1972年Kerr等提出細胞凋亡的概念以來，學者們已逐漸認識到腫瘤與凋亡的相關性〔1〕。促使腫瘤凋亡這種治療方式可以有效地保護人體正常細胞，對人體安全而無副作用。因此，凋亡現(xiàn)已成為抗腫瘤研究的熱點內(nèi)容之一。

核桃青皮是民間抗腫瘤常用的藥物之一。研究人員發(fā)現(xiàn)，核桃青皮提取物具有抗腫瘤作用。核桃青皮水提物抑制小鼠肉瘤S180和小鼠實體型肝癌的生長，并與所用劑量呈現(xiàn)一定的依賴關系〔2〕；核桃楸青皮水提物對機體有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，可以降低小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度〔3，4〕。而從青核桃中分離出的物質(zhì)可以直接殺死體外培養(yǎng)的S180癌細胞，作用呈濃度時間依賴性〔5〕。

此前研究表明，核桃青皮提取物可以抑制腫瘤的體內(nèi)生長〔6〕，但機制不清。本實驗進一步研究核桃青皮提取物誘導肺癌細胞凋亡的作用，由于核桃青皮具有一定的毒性作用，本實驗使用低劑量的核桃青皮提取物，將小鼠Lewis肺癌細胞經(jīng)低濃度核桃青皮提取物作用后，細胞明顯出現(xiàn)凋亡，并具有時顯的時間-劑量效應關系。聯(lián)合常用化療藥物順鉑后，細胞均明顯發(fā)生凋亡；與單獨應用核桃青皮提取物組比較，腫瘤細胞凋亡更加明顯。說明核桃青皮提取物具有促進細胞凋亡的作用，與鉑類化療藥中常用的順鉑有協(xié)同作用。但其對細胞的毒性作用還需進一步研究。

4 參考文獻

1吳海星,侯曉節(jié),徐希妮,等.五味子乙素抗腫瘤的多種作用機制〔J〕.吉林醫(yī)藥學院學報，2012；33(2):107-10.

2王紹林,王紹東,劉今方.核桃楸青果皮的生藥鑒別和抗腫瘤作用研究〔J〕.藥學實踐雜志,1995；13(1):40-2.

3蘭 英,趙 銳.核桃楸青果皮水提物對降低小鼠體內(nèi)丙二醛質(zhì)量濃度的研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版),2000；6(1):476-7.

4蘭 英,房金波,張維晶,等.核桃楸青果皮(GPJM)水提物誘生小鼠腫瘤壞死因子的實臉研究〔J〕.東北師范大學學報(自然科學版),2003；35(1):78-81.

5劉瑞梅.青核桃及刺五加抗癌作用的藥理研究〔J〕.中草藥,1980；11(7):213-4.

6曹志友,歐陽瑾,溫 娜,等.核桃青皮提取物對小鼠Lewis肺癌細胞生長的抑制作用〔J〕.中國實驗診斷學,2012；16(2):232-3.