李 沫 陳立強(qiáng) 孔慶濱

(東北林業(yè)大學(xué)醫(yī)院皮膚科，黑龍江 哈爾濱 150040)

老年人群皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢〔1〕。丹參酮(Tan)ⅡA是從中藥丹參中提取的脂溶性有效成分，對多種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用〔2〕。但TanⅡA對人皮膚鱗狀細(xì)胞癌作用研究尚未見報(bào)道。本研究體外觀察TanⅡA對A431細(xì)胞的生長抑制和誘導(dǎo)凋亡影響，探討其抗皮膚鱗狀細(xì)胞癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑 人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞株(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué))；TanⅡA(中國生物制品檢定所，純度≥98%)；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和DMSO(Sigma公司)；IMDM培養(yǎng)液和胎牛血清(GIBCO公司)；碘化丙啶(PI)和AnnexinV-FITC(BD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) A431細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的IMDM培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48～72 h傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(MTT法) 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，分為實(shí)驗(yàn)組、空白對照組，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為0.5、1、2.5、5、10 μg/ml TanⅡA的 IMDM培養(yǎng)液100 μl，空白對照組加入等體積的不含TanⅡA的IMDM培養(yǎng)液。每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48、72 h后，加入新配置的MTT液，再培養(yǎng)4 h后，加入DMSO溶液，震蕩搖勻，使結(jié)晶充分溶解，置酶標(biāo)儀上測各孔吸光度值(A570 nm)，取6個(gè)復(fù)孔的平均值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率，抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均A570 nm值/對照組平均A570 nm值)×100%。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集不同濃度TanⅡA(0、2.5、5、10 μg/ml)作用48 h的各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，加Annexin V-FITC與PI雙標(biāo)記活細(xì)胞，混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入1×結(jié)合緩沖液充分混合后于流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡情況，應(yīng)用Multicycle AV軟件進(jìn)行凋亡細(xì)胞分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和兩兩比較LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1TanⅡA對A431細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的TanⅡA作用于A431細(xì)胞后，細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，各濃度組與空白對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。0.5 μg/ml組和1.0 μg/ml組TanⅡA對A431細(xì)胞作用24 h生長抑制率差異不明顯(P>0.05)；其余各組在作用時(shí)間相同時(shí)，隨著藥物濃度的增加，對A431細(xì)胞增殖抑制率有明顯增加，各濃度組兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；在同一藥物濃度時(shí)，隨著作用時(shí)間的延長，TanⅡA對A431細(xì)胞增殖抑制率也有明顯差異(P<0.05)。見表1。

2.2TanⅡA對A431細(xì)胞凋亡的影響 2.5、5.0、10.0 μg/ml組細(xì)胞凋亡率(1.31%±0.41%、3.73%±0.74%、6.57%±0.58%)均明顯高于空白對照組(0.26%±0.09%)(P<0.01)。細(xì)胞凋亡率隨著TanⅡA濃度增加而上升(P<0.05)。見圖1。

表1 各組A431細(xì)胞體外增殖抑制率比較

圖1 TanⅡA對A431細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡異常是導(dǎo)致腫瘤形成、發(fā)展的關(guān)鍵原因之一。有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡是臨床應(yīng)用藥物治療腫瘤的思路之一。TanⅡA是從中藥丹參中提取的有效成分，具有一定的抗腫瘤作用，諸多研究者在肺癌〔3〕、鼻咽癌〔4〕、乳腺癌〔5〕、白血病〔6〕等惡性腫瘤的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)TanⅡA具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。本研究也發(fā)現(xiàn)，TanⅡA對體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞具有明顯的生長抑制作用，并能夠誘導(dǎo)其凋亡，且具有劑量時(shí)間依賴性。

本研究結(jié)果表明TanⅡA對于A431細(xì)胞的抑制效應(yīng)有明顯的劑量依賴性。TanⅡA對于A431細(xì)胞的抑制效應(yīng)有明顯的時(shí)間和濃度依賴性。其作用機(jī)制可能與TanⅡA阻滯A431細(xì)胞周期和(或)上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)部分凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，但其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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