侯 陽 李福智 左中夫 劉學(xué)政

(遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心，遼寧 錦州 121001)

黃芪多糖(APS) 為中藥黃芪中重要有效成分之一。研究表明，APS具有廣泛的藥理作用，在糖尿病(DM)治療中具有重要意義〔1〕。DM周圍神經(jīng)病變(DPN)是DM常見的并發(fā)癥之一，周圍神經(jīng)受累的患者可占糖尿病患者的50%～90%，并且隨著年齡與糖尿病病程的增加，DPN發(fā)病率進一步升高〔2〕。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)具有干細胞的共性，即具有自我復(fù)制和不受控制的自發(fā)分化能力，在不同條件下可以分化為所有中胚層來源的組織，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞等〔3～6〕。本文擬通過體外實驗驗證APS注射液誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細胞的分化。

1 材料與方法

1.1材料 4周齡雌雄不限的SD大鼠2只，體重(110±10)g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。DMEM /F12培養(yǎng)基購于HyClone 公司(批號NWF0426)、乙二胺四乙酸(EDTA)購于Sigma公司(批號E6758)、胎牛血清(FBS)購于Thermo Fisher 北京公司(批號NVA0227)、兔抗大鼠單克隆抗體CD44、CD455購于美國 BD 公司(批號分別為5518、55752)。APS：西安鴻生生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號：100223；規(guī)格：1 000 g/袋；純度>95%。

1.2方法

1.2.1BMSCs的培養(yǎng)及鑒定 采用貼壁篩選法和密度梯度離心法獲取BMSCs：取SD大鼠2只，拉頸處死后，酒精浸泡消毒，在不破壞股骨的情況下解剖下肢，將股骨從肢體中分離出來。切除股骨上的肌肉和肌腱，用無菌紗布擦拭除去骨上的剩余組織。剪除骨的兩端，暴露內(nèi)部骨髓。用注射器吸取DMEM/F12 培養(yǎng)基并含15% FBS 5 ml沖洗每根股骨。進行細胞計數(shù)，按1×107細胞/cm2接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于10% CO237℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天進行分瓶。傳至第3代時消化，用鈍頭吸管吹打成單細胞懸液進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度，加入熒光標(biāo)記抗體避光4℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，5 min/次，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)記物CD44、CD45的表達。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測 按照不同的誘導(dǎo)方式將BMSCs分三組：①對照組：10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基；②化學(xué)方法誘導(dǎo)組：誘導(dǎo)前培養(yǎng)孔板內(nèi)加入1 mmol/L的β-巰基乙醇(BME)預(yù)誘導(dǎo)24 h，更換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基及5 mmol/L的BME誘導(dǎo)；③APS組(予黃芪多糖 20 mg/L)。選取誘導(dǎo)的BMSCs，用 PBS(pH 7.2～7.6)漂洗3次后再用10%甲醛固定30～60 min。分別滴加適當(dāng)稀釋的神經(jīng)微管蛋白-βⅢ(Tuj1)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)一抗4℃過夜。再加滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.2.3免疫組織熒光檢測 選取誘導(dǎo)3、5、7 d長有BMSCs的蓋玻片，PBS洗3次，10%甲醛固定細胞30 min，PBS洗3次，30%H2O21份+純甲醇50份混合浸泡15 min，蒸餾水洗3次，3%牛血清白蛋白封閉30 min，分別滴加稀釋的Tuj1、GFAP一抗，陰性對照組用PBS代替一抗，甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察并攝像。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 BMSCs原代時懸浮于培養(yǎng)液中，細胞呈圓形，在顯微鏡下觀察具有很強的折光性。第4～5天時，BMSCs呈多角形、短梭形或不規(guī)則形，傳至三代以后細胞逐漸變?yōu)榧忓N形，細胞排列呈明顯的旋渦狀，經(jīng)流式細胞儀檢測CD44表達陽性，為92.8%。CD45表達陰性，為2.4%，故認為體外培養(yǎng)的細胞為BMSCs。

2.2BMSCs誘導(dǎo)后的形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下觀察APS組，在12 h后就有突起形成，隨時間變化突起漸漸增多、增長；第3天時鏡下觀察細胞有神經(jīng)細胞形態(tài)，細胞核增大，折光性增強，第5天形成2～4個大小不等的突起，細胞突起之間交織成網(wǎng)，隨著時間的延長，幾乎全部細胞都有典型神經(jīng)樣細胞形態(tài)。化學(xué)誘導(dǎo)組在加入誘導(dǎo)劑后細胞有突起伸出，變得細長呈樹枝狀，大部分細胞呈神經(jīng)樣形態(tài)改變，3 d 可見到一些細胞漂浮脫壁，隨時間延長死亡細胞逐漸增多。第7天ACP組可見細胞具有典型的神經(jīng)元樣改變(見圖1)。對照組無典型的神經(jīng)樣細胞形態(tài)。

2.3BMSCs誘導(dǎo)后免疫組化學(xué)和免疫熒光檢測鑒定 ACP組，7 d后可見Tuj1陽性細胞隨著時間的延長突出逐漸增多，可見胞體及核體逐漸增大，突出數(shù)目長短不一，突起進一步分叉相互連接，可見典型的神經(jīng)樣細胞形態(tài)。陰性對照組未見神經(jīng)樣細胞形態(tài)改變(圖2，圖3)。

圖1 鏡下誘導(dǎo)(7 d，×400)

圖2 誘導(dǎo)5 d Tuj1陽性細胞(DAB，×200)

圖3 誘導(dǎo)7 d Tuj1陽性細胞(DAB，×400)

3 討 論

Woodbury等〔7〕首次用β-巰基乙醇、二甲基亞砜和4-羥基茴香醚作為主要誘導(dǎo)劑，在體外成功地將成年大鼠和人BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細胞，誘導(dǎo)后80%細胞在形態(tài)上出現(xiàn)類似神經(jīng)元的突起，表達神經(jīng)元特異性醇化酶(NSE)和神經(jīng)絲蛋白(NF)。隨后，Sanchez-Ramos等〔8,9〕分別用表皮生長因子(EGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和視黃酸(RA)與3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)和雙丁酰環(huán)酰苷酸也在體外將成年大鼠和人BMSCs成功地誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞。項鵬等〔10～13〕利用丹參注射液分別將人、大鼠和兔的BMSCs誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)元樣細胞，誘導(dǎo)后細胞NSE和NF表達陽性，GFAP陰性表達。近些年出現(xiàn)的誘導(dǎo)劑有化學(xué)藥物、細胞因子等，隨后還出現(xiàn)細胞因子和化學(xué)藥物聯(lián)合的方法，這些方法雖然能使BMSCs誘導(dǎo)成神經(jīng)樣細胞，但具有不同的細胞毒性，誘導(dǎo)率一般在50%～60%。之后又有人先后利用麝香多肽、當(dāng)歸、黃芩甙、絞股藍、地黃多糖等作為誘導(dǎo)劑，成功地將不同來源的BMSCs誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)元樣細胞〔14～18〕。本實驗運用APS作為誘導(dǎo)劑，深入研究發(fā)現(xiàn)APS具有廣泛的藥理作用，具有增強免疫系統(tǒng)功能、抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老、降血糖等作用，從而解決體外誘導(dǎo)分化效率低及存活狀況問題。尹雅玲等〔19〕發(fā)現(xiàn)APS組分-A3(APS-A3) ( 0.11，10 mg/ml) 劑量依賴性地保護了對氧磷(PARA)損傷的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)(EDRR)，阻滯了PARA 所致的、內(nèi)皮細胞單層通透性(ECMP) 的升高、凋亡及形態(tài)學(xué)的改變，其保護作用與抗氧化劑超氧化物歧化酶作用相近。應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)劑存在細胞只能短期存活的問題。中藥誘導(dǎo)劑作用長效持久，而多糖類具有非特異性免疫增強作用，能提高機體免疫功能，增強抗病能力，長期使用對組織細胞毒副作用小。

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