王 均 楊小朋 鄭 勇 王繼超 魏文淵 洪 宇

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

膠質(zhì)瘤是臨床常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，發(fā)病率較高，治療效果不佳。其細(xì)胞內(nèi)的IDH1基因易發(fā)生變異，主要是其R132位點(diǎn)發(fā)生點(diǎn)突變，并且約75%的惡性膠質(zhì)瘤被發(fā)現(xiàn)存在這些變異。通過(guò)多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究表明IDH1基因變異可延長(zhǎng)患者的生存期〔1〕。Ki-67是一種細(xì)胞核表達(dá)的抗原，是膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性評(píng)估的理想標(biāo)記物。Mastronardi等〔2〕研究表明Ki-67標(biāo)記指數(shù)(LI)增加，腫瘤的惡性程度增加，其可反映膠質(zhì)瘤的惡性程度及一定程度提示患者的預(yù)后。腫瘤微血管密度(MVD)是評(píng)估血管新生的方法，Leon等〔3〕研究顯示其也是評(píng)價(jià)患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)，正常腦組織中也表達(dá)。IDH1基因變異與預(yù)后的具體作用機(jī)制仍不清楚，IDH1基因是否通過(guò)降低膠質(zhì)瘤的增殖活性降低腫瘤的惡性程度及改變患者的預(yù)后仍不清楚。

1 材料與方法

1.1材料 選取2011年1月至2012年6月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)標(biāo)本45例，已經(jīng)該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。男性26例、女性19例，年齡24～72〔平均(46.37±3.23)〕歲。病理結(jié)果按照2000年世界衛(wèi)生組織(WHO)腦腫瘤病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ級(jí)(毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤)2例，Ⅱ級(jí)(彌漫性星形細(xì)胞瘤、纖維型星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤)16例，Ⅲ級(jí)(間變性星形細(xì)胞瘤、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤)10例，Ⅳ級(jí)(多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)肉瘤)12例，將Ⅰ,Ⅱ級(jí)歸為低級(jí)別,Ⅲ、Ⅳ級(jí)歸為高級(jí)別。分為變異組20例，Ⅱ級(jí)11例、Ⅲ級(jí)6例、Ⅳ級(jí)3例；未變異組20例，Ⅰ級(jí)2例、Ⅱ級(jí)5例、Ⅲ級(jí)4例、Ⅳ級(jí)9例。5例腦外傷內(nèi)減壓手術(shù)所取正常腦組織(額葉或顳葉)標(biāo)本為空白對(duì)照組。冰凍標(biāo)本采集后均迅速置于液氮中，-80℃凍存?zhèn)溆?。IDH1基因變異檢測(cè)工作已完成〔4〕。主要試劑有SP試劑盒及鼠抗人CD34、Ki-67單克隆抗體均從上海銳賽生物技術(shù)有限公司購(gòu)得。

1.2MVD免疫組化染色及分析 組織標(biāo)本常規(guī)甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片機(jī)切片厚度4 μm，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(SP)行CD34的免疫組化染色。操作步驟：切片脫蠟水化，蒸餾水中5 min，用蒸餾水配制新鮮的3%H2O2室溫封閉10 min蒸餾水洗1次，抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min，滴加一抗，置4℃冰箱過(guò)夜，過(guò)夜后在37℃復(fù)溫45 min，PBS洗2次各5 min，滴加生物素標(biāo)記的二抗孵育30 min，PBS洗2次各5 min，滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶孵育30 min，PBS洗2次各5 min，DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，蒸餾水洗終止染色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片，鏡檢。每組均有陽(yáng)性及陰性對(duì)照，CD34表達(dá)陽(yáng)性為微血管內(nèi)皮細(xì)胞染成棕黃色。鏡下微血管計(jì)數(shù)，按Weidner〔5〕血管計(jì)數(shù)法進(jìn)行，低倍鏡下選擇5個(gè)CD34陽(yáng)性染色最多的區(qū)域作為熱點(diǎn)，然后用高倍鏡(×200)在眼網(wǎng)格下0.25 mm2范圍內(nèi)計(jì)數(shù)，任何管腔或單一血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕黃色作為一個(gè)微血管計(jì)數(shù)，5個(gè)高倍鏡視野下計(jì)數(shù)的微血管平均值作為此標(biāo)本的MVD。

1.3Ki-67檢測(cè)及結(jié)果分析 組織標(biāo)本運(yùn)用SP法行Ki-67免疫組織化學(xué)染色，染色方法同血管密度檢測(cè)。Ki-67染色腫瘤細(xì)胞核有棕黃色著色為陽(yáng)性，Ki-67 LI按照陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行定量分析，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專業(yè)醫(yī)生在高倍鏡視野下(×400)計(jì)算每100個(gè)腫瘤細(xì)胞中Ki-67標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比，每個(gè)組織標(biāo)本任取10個(gè)高倍視野(×400)計(jì)數(shù)取平均值，兩者的計(jì)數(shù)取平均值。把Ki-67 LI分為4級(jí)：弱陽(yáng)性(±)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于25%；陽(yáng)性(+)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)25%～50%；中度陽(yáng)性()，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)50%～75%；強(qiáng)陽(yáng)性()，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大于75%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1MVD檢測(cè)結(jié)果 變異組MVD較未變異組減低(t=2.328，P=0.025)，空白對(duì)照組較變異組及未變異組均降低 (P<0.05)。Ⅰ+Ⅱ級(jí)別膠質(zhì)瘤MVD表達(dá)較高級(jí)別膠質(zhì)瘤低(23.94±8.03和45.54±8.19,t=-8.369,P<0.001)，MVD表達(dá)隨腫瘤級(jí)別增高而增加。見表1和圖1。

2.2Ki-67表達(dá)結(jié)果 Ki-67在空白對(duì)照組不表達(dá)，各級(jí)膠質(zhì)瘤中均有表達(dá)(圖2)，表達(dá)定位于細(xì)胞核，細(xì)胞核被染成棕黃色，變異組Ki-67表達(dá)較未變異組減低(t=2.134，P=0.039)。Ⅰ+Ⅱ級(jí)別膠質(zhì)瘤Ki-67表達(dá)較Ⅲ+Ⅳ級(jí)別膠質(zhì)瘤低〔(8.36%±2.84%)vs(25.55%±7.53%),t=9.138，P<0.001〕。Ⅰ～Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤采用單因素方差分析比較Ki-67表達(dá)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，膠質(zhì)瘤級(jí)別越高Ki-67蛋白表達(dá)也越高，見表1。變異組Ki-67表達(dá)弱陽(yáng)性16例，陽(yáng)性4例；非變異組弱陽(yáng)性表達(dá)12例，陽(yáng)性8例；兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=-1.363，P=0.173)。

Ⅰ級(jí) Ⅱ級(jí) Ⅳ級(jí)

空白對(duì)照組 未變異組低級(jí)別膠質(zhì)瘤 未變異組高級(jí)別膠質(zhì)瘤

表1 各組Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞率及MVD表達(dá)比較

3 討 論

惡性膠質(zhì)瘤在每年新增原發(fā)惡性腦腫瘤中約占70%。最初發(fā)現(xiàn)IDH1基因突變是在膠質(zhì)瘤的亞型中大規(guī)?；驕y(cè)序〔6〕，IDH1基因變異主要發(fā)生在Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中，較少在Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中發(fā)生。IDH1基因突變主要在R132位點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)約75%的惡性膠質(zhì)瘤存在這類突變。學(xué)者發(fā)現(xiàn)IDH1基因變異發(fā)生在膠質(zhì)瘤形成的早期〔7〕，并通過(guò)多項(xiàng)臨床實(shí)驗(yàn)研究表明IDH1基因通過(guò)降低NADPH的水平，從而增加膠質(zhì)瘤對(duì)于放療及化療的敏感性，延長(zhǎng)患者的生存期〔8〕。

膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因分子水平相互作用的復(fù)雜過(guò)程，不同功能的基因或蛋白水平的相互誘導(dǎo)協(xié)同和拮抗。Ki-67是Gerdes等〔9〕發(fā)現(xiàn)的一種IgG1單克隆抗體，在增殖細(xì)胞中識(shí)別一種核心抗原的提呈，而在靜息狀態(tài)下的細(xì)胞中缺失。隨后的研究提示Ki-67在膠質(zhì)瘤中是重要的臨床標(biāo)記物之一〔10〕?，F(xiàn)已被廣泛運(yùn)用于膠質(zhì)瘤的診斷及預(yù)后評(píng)價(jià)中，同其他反映細(xì)胞增殖的臨床指標(biāo)如DNA聚合酶、細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)等相比優(yōu)勢(shì)在于Ki-67半衰期較短，蛋白在增殖周期后降解迅速，能更好地反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性及其惡性程度，提示患者的預(yù)后。Ki-67蛋白的高表達(dá)水平提示間變型星形細(xì)胞瘤患者存活時(shí)間較短〔11〕。MVD已被證實(shí)是評(píng)價(jià)侵襲性腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)，有人認(rèn)為血管密度可能與年齡、性別等有關(guān)，Duda等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的血管發(fā)達(dá)但分布不均，腫瘤組織邊緣血管豐富但也有無(wú)血管區(qū)域，且腫瘤的血管密度與腫瘤內(nèi)部的位置、患者性別和年齡之間無(wú)關(guān)聯(lián)，說(shuō)明膠質(zhì)瘤的預(yù)后與年齡、性別等無(wú)關(guān)聯(lián)。新生血管為腫瘤的生長(zhǎng)提供必需的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與多種類型腫瘤的轉(zhuǎn)移及生存期有關(guān)，新生血管的形成會(huì)發(fā)生多種生理和病理過(guò)程，血管的腫瘤的惡變和轉(zhuǎn)移都依賴血管的生成〔13～15〕。腫瘤血管發(fā)育不成熟導(dǎo)致其基底膜不完整或缺乏為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供直接的通道。大多數(shù)腫瘤的血管密度越高，是一個(gè)不利的預(yù)后指標(biāo)，它增加轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，膠質(zhì)瘤也不例外。血管密度的檢測(cè)目前較常用的有抗血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31、CD34抗原來(lái)標(biāo)記微血管，由于CD31標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞染色較淺〔16〕，計(jì)數(shù)時(shí)難度較大且增加誤差，因此本實(shí)驗(yàn)用CD34標(biāo)記微血管。

本研究發(fā)現(xiàn)，變異組Ki-67蛋白表達(dá)較非變異組增高，并隨腫瘤級(jí)別增高而增高，這與Yan等〔17〕的研究在初級(jí)膠質(zhì)瘤IDH1基因突變組Ki-67蛋白表達(dá)顯著低于野生型組的結(jié)論相同，并且IDH1基因變異患者的生存期延長(zhǎng)與IDH1基因突變伴隨增殖率降低有關(guān)。本研究結(jié)果表明腫瘤惡性程度越高Ki-67蛋白高表達(dá)，此結(jié)論與以往相關(guān)研究〔18～20〕結(jié)果相同。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中Ki-67表達(dá)增高表明腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞增殖活躍，惡性程度增加，預(yù)后較差。本實(shí)驗(yàn)Ki-67表達(dá)較其他研究偏低，等級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與陽(yáng)性細(xì)胞的定義有關(guān)，由于一些染色較弱的陽(yáng)性細(xì)胞被歸為陰性細(xì)胞。微血管在正常腦組織中也表達(dá)，但本實(shí)驗(yàn)?zāi)z質(zhì)瘤標(biāo)本中表達(dá)明顯高于正常腦組織，說(shuō)明膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)迅速所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和耗氧增加，新生血管適應(yīng)性增多。隨腫瘤級(jí)別增高M(jìn)VD有增高的趨勢(shì)，因此MVD可作為預(yù)測(cè)腫瘤惡性程度的指標(biāo)。IDH1基因變異影響新生血管的形成，導(dǎo)致腫瘤血管生成減低，侵襲性及惡性程度降低。Chaloob等〔21〕研究顯示MVD和Ki-67蛋白表達(dá)之間有顯著相關(guān)性，膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，腫瘤新生血管密度增多。

本研究結(jié)果間接提示IDH1基因變異影響腫瘤的能量代謝，而能量代謝受阻降低細(xì)胞的增殖活性，使大量細(xì)胞處于休眠期，導(dǎo)致新生血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂緩慢，新生腫瘤血管數(shù)量減低，惡變和轉(zhuǎn)移受到抑制，患者的預(yù)后較好。IDH1基因突變雖是一個(gè)良好的膠質(zhì)瘤臨床療效標(biāo)記物〔22～24〕，但其在膠質(zhì)瘤中的發(fā)生發(fā)展機(jī)制仍未完全清楚，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)基因突變對(duì)腫瘤增殖活性有一定影響，但尚需完全明確其對(duì)腫瘤增殖的影響。

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