胡 南 李雪巖 林春榮 董海影 謝志平 牛英才 興桂華

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

老年性癡呆(AD)是一種原因不明、以認知功能減退為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其患病率在世界各國均呈上升趨勢，在發(fā)達國家已列于第四大死因〔1〕。AD形態(tài)學上主要病理特征為神經(jīng)元纖維纏結(jié)、老年斑和神經(jīng)元丟失。研究證實，神經(jīng)細胞的凋亡是AD發(fā)生的一個重要機制〔2〕，AD腦內(nèi)神經(jīng)元的丟失機制與細胞凋亡有關(guān)〔3〕。養(yǎng)壽丹是出自《御藥院方》的傳統(tǒng)名方，具有延緩衰老、抗應激及免疫調(diào)節(jié)、改善學習記憶功能及抗AD等藥理作用〔4～6〕。本實驗采用大鼠基底核內(nèi)聯(lián)合注射β-淀粉樣蛋白1～40(Aβ1～40)和興奮性氨基酸，誘導AD動物模型，探討?zhàn)B壽丹對AD海馬區(qū)半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)mRNA表達的影響，以揭示養(yǎng)壽丹對神經(jīng)細胞凋亡保護作用的可能機制，從而為臨床防治AD 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 養(yǎng)壽丹組成：何首烏、熟地、巴戟、枸杞子、川斷、牛膝、肉蓯蓉、茯苓、菟絲子、白術(shù)、遠志、石菖蒲等，上述藥材均購自安國市弘發(fā)中藥材飲片有限公司，處方中各味藥比例為3∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶1.5∶2∶1.5∶1.5∶1.5∶1∶1〔7〕。加水煎煮2次，第1次3 h，第2次2 h，合并煎液，濾過，濃縮液含生藥5.6 g/ml， 貼標簽后將藥液貯存于4℃保存?zhèn)溆?。Aβ1～40為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。鹽酸多奈哌齊片由衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司制造，產(chǎn)品批號110917A。鵝膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBO, Sigma公司)，均為分析純。

1.2動物與分組 健康雄性清潔級SD大鼠100只，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司，許可證編號SCXK(吉)2011-0004，鼠齡8～12 w，體重(280±20)g，經(jīng)適應性飼養(yǎng)1 w，隨機分為空白組、假手術(shù)組、模型組、鹽酸多奈哌齊組(西藥對照組)和養(yǎng)壽丹組，每組20只。

1.3主要儀器及試劑 SYBR?ExScriptTMRT-PCR kit(Perfect Real Time)為TAKARA公司產(chǎn)品，RNAiso Reagent為TAKARA公司產(chǎn)品，DEPC為瑞興化學產(chǎn)品。ABI7300熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品，2700型PCR System擴增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。FACS Calibur流式細胞儀為美國BD公司。UV-2550型紫外分光光度計為日本島津產(chǎn)品。江灣Ⅰ型C立體定向器(第二軍醫(yī)大學)。

1.4方法

1.4.1造?！?〕將實驗大鼠用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉后，立體定位儀固定頭部，備皮消毒，沿顱頂中線作2 cm切口，分離骨膜暴露頭骨，以前囟門為基點，由前囟向后0.5 mm，再從正中向右移至2.8 mm處，用牙科鉆打開顱骨，垂直插入微量注射器，使針尖自腦表面進針7 mm至Myenert核，將1 μl溶液(內(nèi)含Aβ1～404 μg和IBO 1 μg溶于生理鹽水)混合液緩慢注入，20 min內(nèi)分4次注射完畢，留針5 min，縫合皮膚。模型組、鹽酸多奈哌齊組、養(yǎng)壽丹組分別注射1 μl Aβ1～40和Iboteni cacid的混合液。用同樣方法假手術(shù)組注射1 μl生理鹽水。

1.4.2給藥方法 造模后第3天開始給予藥物干預，根據(jù)人和動物按體表面積折算的等效劑量?？瞻讓φ战M、假手術(shù)組、模型組均按0.5 ml/100 g體重給予生理鹽水灌胃，1次/d，鹽酸多奈哌齊對照組按0.33 mg·kg-1·d-1，養(yǎng)壽丹組(含5.6 g生藥/ml)給藥，灌胃方法同模型組，連續(xù)2個月。

1.4.3流式細胞技術(shù)檢測海馬區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡率 行為學測試完成后，每組各取5只大鼠，斷頭處死，在冰臺上開顱，快速取出海馬組織。滴加無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)1.5 ml沖洗1次，將組織剪碎后，放入于50 μm無菌旋液中，并用流式樣品制備儀制成單細胞懸液；用2.5 ml注射器抽取懸液，經(jīng)0.7 μm，200目規(guī)格的濾網(wǎng)過濾到離心管中，離心5 min(1 500 r/min)，棄去上清液；加入緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)細胞濃度約1×106個/ml，然后用冰凍的PBS沖洗1次，輕輕震蕩，使細胞懸浮，離心，去上清；加入10 μl的AnnexinV-FITC和5 μl的PI，輕輕搖勻，避光室溫孵育 15 min 。加入400 μl Binding Buffer后，在1 h內(nèi)上流式細胞儀測定。

1.4.4熒光實時定量PCR檢測大鼠大腦海馬組織Caspase-3 mRNA表達 總RNA的提?。?按RNAiso Reagent操作說明書提取大鼠右側(cè)海馬組織總RNA，紫外分光光度計分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。逆轉(zhuǎn)錄反應： 逆轉(zhuǎn)錄反應在2700型PCR System擴增儀上按SYBR?ExScriptTMRT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄反應試劑盒方法操作，反應參數(shù)如下：反轉(zhuǎn)錄反應42℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應95℃ 2 min。PCR反應采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) kit試劑，在ABI 7300熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進行。引物由TaKaRa公司設(shè)計合成，引物序列如下：Caspase-3：上游引物序列為5′-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3′，下游引物序列為5′-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3′。GAPDH：上游引物序列為5′-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3′；下游引物序列為5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。反應條件如下：第一步是預變性，95℃，10 s (1個循環(huán))。第二步是PCR反應，95℃，5 s；60℃，31 s(40個循環(huán))。反應結(jié)束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析PCR過程個檢測樣本的Ct(Threshold cycle)值。

2 結(jié) 果

2.1養(yǎng)壽丹對實驗大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率的影響 模型組(18.27±0.66)比空白對照組(4.10±0.30)、假手術(shù)組(4.36±0.59)神經(jīng)細胞凋亡率明顯升高，而養(yǎng)壽丹組海馬神經(jīng)細胞凋亡情況(14.32±0.64)較模型組明顯改善(均P<0.05)，鹽酸多奈哌齊組凋亡率(13.78±0.95)與模型組比較差異顯著(P<0.05)。

2.2養(yǎng)壽丹對AD模型大鼠海馬組織Caspase-3 mRNA表達的影響 模型組Caspase-3 2-△△CT明顯升高，與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)；與模型組相比較，假手術(shù)組、養(yǎng)壽丹組Caspase-3 2-△△CT均明顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 養(yǎng)壽丹對AD模型大鼠海馬組織Caspase-3 mRNA表達的影響

3 討 論

AD是一種嚴重影響老年人健康及其家庭生活質(zhì)量的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，已成為當前導致老年人死亡的重要原因之一。因此，老年病防治已成為我國十分緊迫的社會和醫(yī)學問題，研究AD的發(fā)病機制和防治措施，具有重要的醫(yī)學科學價值和社會現(xiàn)實意義。研究表明，Aβ引起神經(jīng)細胞凋亡，導致AD患者腦內(nèi)神經(jīng)細胞和突觸丟失，最后引起AD〔9〕。Aβ誘發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡可能是AD認知功能障礙的主要病理學基礎(chǔ)。在AD發(fā)病早期即出現(xiàn)突觸和神經(jīng)元的大量丟失，而AD腦內(nèi)神經(jīng)元的丟失機制與細胞凋亡有關(guān)，細胞凋亡是引起神經(jīng)元丟失的重要途徑，并受Caspase家族和Bcl-2家族調(diào)控。近年來，Caspase家族是與細胞凋亡最密切相關(guān)的一類蛋白酶，Caspase蛋白酶激活是細胞凋亡發(fā)生過程中的中心環(huán)節(jié) 。其中Caspase-3是細胞凋亡信號途徑中最關(guān)鍵的效應酶，在凋亡信號轉(zhuǎn)導中起重要的核心作用〔10〕，它被公認是細胞凋亡蛋白級聯(lián)反應的必經(jīng)之路〔11〕。新近研究〔12，13〕認為，Aβ活化 Caspase-3可剪輯 Tau，導致 Tau 的積聚，參與AD發(fā)病過程。因此，Caspase-3是治療神經(jīng)退行性疾病的新靶點，尋找Caspase-3高效高選擇性的抑制劑將為治療神經(jīng)退行性疾病提供新的途徑〔14〕。

中醫(yī)認為，腎主骨生髓，腦為髓之海，腎腦關(guān)系尤為重要。衰老的發(fā)生發(fā)展，學習記憶能力的下降以及AD的發(fā)病均與增齡性的腎虛密切相關(guān)。腎虛髓減是AD發(fā)病的關(guān)鍵因素所在，由于腎精不足，髓?？仗摱翧D，學習記憶能力下降。因此，中醫(yī)臨床防治AD多以補腎為主要原則，運用補腎方藥進行治療，且具有獨特的療效。補腎填精、化痰開竅法是治療AD的基本治法。研究還表明，養(yǎng)壽丹具有延緩衰老、抗應激及免疫調(diào)節(jié)、改善學習記憶功能及抗AD等藥理作用。本實驗流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，養(yǎng)壽丹能夠抑制Aβ和興奮性氨基酸所致的細胞凋亡，減少神經(jīng)元的凋亡數(shù)量，對損傷的神經(jīng)細胞起到保護作用。RT-PCR檢測結(jié)果表明，AD發(fā)生可能是由于Caspase-3 mRNA被激活，進而導致神經(jīng)細胞不可逆性凋亡，造成腦內(nèi)神經(jīng)細胞和突觸丟失，最終引起AD，并且提示養(yǎng)壽丹對細胞凋亡執(zhí)行蛋白 Caspase-3 表達具有調(diào)控效應。因此，推測養(yǎng)壽丹可能通過下調(diào)Caspase-3的表達，阻止Caspase-3誘導的凋亡級聯(lián)效應發(fā)生，減少了神經(jīng)元丟失，從而發(fā)揮抗神經(jīng)細胞凋亡的保護作用，可能為養(yǎng)壽丹防治AD的作用機制之一。

4 參考文獻

1Gamaldo A, Moghekar A, Kilada S,etal.Effect of a clinical stroke on the risk of dementia in a prospective cohort〔J〕.Neurology,2006；67(8):1363-9.

2Yang DS, Kumar A, Stavrides P,etal.Neuronal apoptosis and autophagy cross talk in aging PS/APP mice, a model of Alzheimer′s disease〔J〕.Am J Pathol, 2008；173(3): 665-81.

3Caricasole A,Copani A,Caraci F,etal.Induction of Dickkopf-1，a negative modulator of the wnt pathway，is associated with neuronal degeneration in alzheimer's brain〔J〕.J Neurosci，2004；24(26):6021-7.

4黃兆勝,孫維廣,劉明平,等.養(yǎng)壽丹對腎陽虛癡呆模型的抗衰益智作用觀察〔J〕.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志, 2003；9(6):436-9.

5黃兆勝,孫維廣,劉明平,等.養(yǎng)壽丹對阿爾茨海默病腎陽虛模型大鼠學習記憶的影響〔J〕.中成藥, 2002；24(2):113-5.

6王 玲,黃兆勝,劉明平,等.養(yǎng)壽丹對Alzheimer病模型大鼠學習記憶的影響研究〔J〕.中醫(yī)藥學刊，2005；23(1):136-8.

7黃兆勝,劉明平,孫維養(yǎng),等.養(yǎng)壽丹對阿爾茨海默病腎陽虛大鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2002；8(2):26-8.

8陳 勤,胡雅兒,夏宗勤.知母皂甙元對腦內(nèi)注射β- 淀粉樣肽癡呆模型大鼠的影響〔J〕.上海第二醫(yī)科大學學報，2001；21(5):401-3.

9Biswas SC, Shi Y, Vonsattel JP,etal.Bim is elevated in Alzheimer's disease neurons and is required for beta-amyloid-induced neuronal apoptosis〔J〕.J Neurosci, 2007；27(4):893-900.

10張擁波,羅 勇,董為偉.Caspase-3在腦缺血神經(jīng)元損傷中的作用〔J〕.國外醫(yī)學·腦血管病分冊,2000；8(2)：79-81.

11Cheng EH,Kisch DG, Clem RJ,etal.Conversion of bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases〔J〕.Science, 1997；278(5345)：1966-8.

12Prvulovic D，Hampel H.Amyloid β (Aβ) and phospho-tau(p-tau) as diagnostic biomarkers in Alzheimer＇s disease〔J〕.Clin Chem Lab Med，2011；49(3)：367-74

13Marwarha G，Dasari B，Prabhakara JP,etal.β-Amyloid regulates leptin expression and tau phosphorylation through the mTORC1 signaling pathway〔J〕.J Neurochem，2010；115(2)：373-84.

14Louneva N,Cohen JW,Han LY，etal.Caspase-3 is enriched in postsynaptic densities and increased in Alzheimers Disease〔J〕.Am J Pathol,2008；173(5):1488-95.