龐 娟 宋小峰

(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001)

細(xì)胞凋亡是受多種基因精確調(diào)控的主動(dòng)的程序化的死亡過(guò)程，在多細(xì)胞生物的組織分化、器官發(fā)育和機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要的作用〔1〕。細(xì)胞色素C(Cyt-c)是線粒體中第一個(gè)被鑒定出的細(xì)胞凋亡因子，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中Cyt-c釋放進(jìn)入胞質(zhì)，是線粒體釋放的最重要的促凋亡因子之一〔2〕。細(xì)胞凋亡在腎各結(jié)構(gòu)的發(fā)育中起著重要的作用〔3，4〕。目前，有關(guān)腎發(fā)育中細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究國(guó)外已有一定報(bào)道，但正常腎發(fā)育中凋亡相關(guān)蛋白Cyt-c的表達(dá)及作用的系統(tǒng)研究還很少見(jiàn)，其對(duì)腎發(fā)育的影響還有待進(jìn)一步的完善〔5〕。本研究擬探討大鼠腎發(fā)育中Cyt-c的表達(dá)規(guī)律及對(duì)腎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和抗體 選用成年健康SD大白鼠，雌、雄(2∶1)同窩飼養(yǎng),3次/d觀察受孕情況，以觀察到陰道栓脫落的最早時(shí)間計(jì)為胚齡(E)0 d。孕鼠分籠飼養(yǎng)2 w后，2次/d觀察生產(chǎn)情況，以觀察到仔鼠出生的最早時(shí)間計(jì)為生后(P)0 d。選取E16、18、20 d的胎鼠和P1、3、5、7、14、21 d的仔鼠，每組取6只。

抗體：鼠抗Cyt-c單克隆抗體(購(gòu)于Abcam公司)； PV試劑盒(購(gòu)于北京中杉試劑公司)。

1.2石蠟切片的制備 各齡孕鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉后剖腹取出胎鼠，各齡胎鼠剖腹取腎；生后各齡仔鼠經(jīng)乙醚麻醉后，經(jīng)4%多聚甲醛與1%戊二醛灌流固定，取腎，常規(guī)脫水透明，石蠟定向包埋，連續(xù)切片(5 μm厚)。

1.3PV法檢測(cè)Cyt-c陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞 將石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；高溫高壓修復(fù)，室溫下冷卻；鼠抗Cyt-c單克隆抗體 (1 μg/ml)濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜;羊抗鼠IgG,37℃20 min; 二氧基聯(lián)苯胺(DAB)顯色;蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片;以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照，光鏡下觀察。

1.4免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集待用腎組織，加入100 μl 蛋白提取緩沖液，于組織勻漿機(jī)上勻漿后，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清，置于-70℃?zhèn)溆?。電泳前，加入十二烷硫酸鈉(SDS)樣品緩沖液，100℃煮沸5 min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h， 鼠抗Cyt-c單克隆抗體(1 μg/ml)4℃孵育過(guò)夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜10 min 3次，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG(1∶2 000)二抗孵育2 h，TBST洗膜10 min 3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

圖1 Cyt-c蛋白免疫組織化學(xué)顯色

2 結(jié) 果

2.1Cyt-c蛋白免疫組織化學(xué)顯色 見(jiàn)圖1。Cyt-c陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)上，呈不同程度的棕黃色顆粒狀，而Cyt-c陰性細(xì)胞的細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)紫色。從E16～20 d時(shí)，皮質(zhì)區(qū)Cyt-c的陽(yáng)性細(xì)胞主要出現(xiàn)于近髓質(zhì)區(qū)的近端小管和遠(yuǎn)端小管內(nèi)，近端小管的表達(dá)強(qiáng)于遠(yuǎn)端小管，腎小體內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞極少見(jiàn)；髓質(zhì)區(qū)的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞主要出現(xiàn)在與梯狀間充質(zhì)垂直排列的放射狀小管內(nèi)。P1～7 d時(shí)，皮質(zhì)區(qū)Cyt-c的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞隨著生腎區(qū)的變薄逐漸增多，主要表達(dá)中層和深層的腎皮質(zhì)區(qū)，髓放線的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞也逐漸增多，但仍集中在放射狀小管上。P14～21 d時(shí)，皮質(zhì)區(qū)的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞位于皮質(zhì)全層；髓質(zhì)區(qū)的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較多，以外髓放射狀走行的小管居多。

2.2免疫印跡分析結(jié)果 免疫印跡結(jié)果顯示，大鼠腎發(fā)育中Cyt-c的蛋白表達(dá)從E16 d～P7 d逐漸升高，P7 d時(shí)達(dá)到高峰，以后則逐漸降低，在P7 d后表達(dá)微弱。見(jiàn)圖2。

圖2 免疫印跡結(jié)果分析

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，隨著發(fā)育的不斷進(jìn)行，Cyt-c的表達(dá)從皮質(zhì)的近髓質(zhì)區(qū)逐漸擴(kuò)展到整個(gè)皮質(zhì)區(qū)，其表達(dá)主要分布于近端小管和遠(yuǎn)端小管。

Cyt-c是一個(gè)水溶性蛋白質(zhì)，與線粒體內(nèi)膜呈松弛相連〔6〕。當(dāng)發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，在凋亡信號(hào)的作用下，Cyt-c釋放到細(xì)胞質(zhì)并與凋亡蛋白激活因子半胱氨酸蛋白酶原(Apaf-1)聚合，聚合的Apaf-1募集并活化半胱氨酸蛋白酶(pro-caspase-9),caspase-9激活下游的效應(yīng)酶caspase-3,最終引發(fā)線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此，Cyt-c陽(yáng)性細(xì)胞的多少可以反映細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，其表達(dá)與線粒體的含量及分布有一定的相關(guān)性〔7，8〕。腎近端小管和遠(yuǎn)端小管的胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體。本研究顯示，在大鼠胚胎及生后腎的發(fā)育過(guò)程中Cyt-c均有不同程度的表達(dá)，且主要表達(dá)于近端小管和遠(yuǎn)端小管，這或許表明由Cyt-c線粒體通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與大鼠腎發(fā)育密不可分。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cyt-c的表達(dá)從E16 d～P7 d逐漸升高，P7 d達(dá)到高峰；通過(guò)對(duì)腎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞增殖的研究也發(fā)現(xiàn)增殖的細(xì)胞在P7 d達(dá)到高峰，這表明在腎的發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡維持著動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞凋亡維持了生物體數(shù)目的動(dòng)態(tài)平衡，以消除那些注定要死亡的細(xì)胞，以免導(dǎo)致發(fā)育異?；蚰[瘤〔9〕。

在腎發(fā)育過(guò)程中伴隨著細(xì)胞生長(zhǎng)分化的同時(shí)也發(fā)生了大量的細(xì)胞凋亡，而凋亡過(guò)程受到機(jī)體的嚴(yán)密監(jiān)控。對(duì)Cyt-c的深入研究將有助于揭示腎發(fā)生發(fā)育的機(jī)制，并為腎疾病的預(yù)防及治療提供新思路。

4 參考文獻(xiàn)

1Wyrwicz-Zielinska G, Fedak D, Kuzniewski M,etal.The relationship between serum soluble apoptosis marker (sTRAIL) concentration and nutritional parameters in hemodialyzed patients〔J〕. Przegi Lek, 2013;70 (7):427-30.

2李 慢，韓 芳，石玉秀.細(xì)胞色素C氧化酶在PTSD大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元過(guò)表達(dá)〔J〕. 解剖科學(xué)進(jìn)展, 2010; 16(2):140-2.

3Ye Y, Wang B, Jiang X,etal. Proliferative capacity of stem/progenitor-like cells in the kidney may associate with the outcome of patients with acute tubular necrosis 〔J〕. Hum Pathol, 2011; 42(8): 1132-41.

4Mozaffar MS, Abdelsated R, Liu JY,etal. Renal diatal tubule proliferation and increased aquaporin-2 level but decreased urine osmolality in db/db mouse;treatment with chromium picolinate 〔J〕. Exp Mol Pathol, 2012; 92(1): 54-8.

5Zhang A, Fu S, Chen L,etal. Lacidipine attenuates apoptosis via a caspase-3 dependent pathway in human kidney Cells 〔J〕. Cell Physiol Biochem, 2013;32(4):1040-9.

6Faccenda D, Tan CH, Duchen MR,etal. Mitochondrial IF1preserves cristae structure to limit apoptotic cell death signaling〔J〕. Cell Cycle, 2013;12(16):2530-2.

7Ng H, Smith DJ, Nagley P. Application of flow cytometry to determine differential redistribution of cytochrome c and Smac/ DIABLO from mitochondria during cell death signaling〔J〕. PloS One,2012;7(7)：e42298.

8Zhang ZF, Guo Y，Zhang JB,etal.Induction of apoptosis by chelerythrine chloride through mitochondrial pathway and Bcl-2 family proteins in human hepatoma SMMC-7721 cell〔J〕.Arch Pharm Res,2011;34(5): 791-800.

9Tang N, Jin J, Deng Y,etal. LASS2 interacts with V-ATPase and inhibits cell growth of hepatocellular carcinoma〔J〕. Sheng Li Xue Bao,2010;62(3): 196-202.