韓國亮 任黨麗 趙 英 張 梅 張文成 羅玉玉

(天津醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，天津 300070)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管疾病的首要病因〔1〕。ZNF580是本課題組以低密度脂蛋白(LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞得到的一個新基因(GenBank注冊號：AF184939)〔2〕，其cDNA編碼由172個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，屬于C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族的新成員。課題組在前期的研究工作中利用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎腦cDNA文庫獲得了可能與ZNF580存在相互作用的多種蛋白，并進(jìn)一步證實(shí)在真核細(xì)胞中Smad2與ZNF580之間存在相互作用。Smad2是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子，此通路的活化參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及血管重構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)形成等，可能與AS的發(fā)生相關(guān)〔3～5〕。本研究采用不同濃度TGF-β刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926，并檢測ZNF580基因表達(dá)的改變，進(jìn)一步闡明ZNF580與TGF-β信號通路間可能存在的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供，TRIZOL試劑、TGF-β、RT-PCR試劑盒購自鼎國生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926用含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次。

1.2.2ZNF580、GAPDH引物合成 根據(jù)GenBank 發(fā)表的ZNF580 cDNA序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物。ZNF580引物:5’- AAA AAG ATC TTG CCC GGA GTG CGC CCG TG-3’，3’- AAA AAG CTT GTG GAG GCG CAC GTG CTG -5’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為273 bp；GAPDH引物:5’-TGA AGG TCG GAG TCA ACG GAT TTG GT-3’，3’-CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC-5’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為982 bp。

1.2.3不同濃度TGF-β刺激內(nèi)皮細(xì)胞 取對數(shù)生長期EA.hy926細(xì)胞接種于6孔板，無血清培養(yǎng)基饑餓12 h后，向每個孔中加入不同濃度的TGF-β ，濃度分別為：0、0.25、0.5、1、2、4 ng/ml。12 h后收集細(xì)胞，加入Trizol充分裂解細(xì)胞，準(zhǔn)備提取總RNA。

1.2.4總RNA提取及鑒定 按Trizol試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測總RNA濃度及純度。

1.2.5目的片段的RT-PCR擴(kuò)增 RT反應(yīng)：按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，每20 μl反應(yīng)體系內(nèi)含有4 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，0.5 μl RNA酶抑制劑，1 U AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5 μg Oligo(dT)引物，2.0 μg RNA模板。以上試劑混合后于42 ℃反應(yīng)60 min，然后于99 ℃加熱5 min，滅活酶活性，立即置冰水浴10 min。

PCR反應(yīng)：用上述逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模板擴(kuò)增ZNF580。每25 μl反應(yīng)體系內(nèi)含14.5 μl 2×PCR 緩沖液，2 μl 25 mmol/L MgCl2，2 μl 10 mmol/L dNTP 混合物，0.5 μl(2.5 U)Taq DNA 聚合酶,1 μl 25 pmol/L 引物，5 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min;30×(94 ℃ 45 s,59 ℃ 45,72 ℃ 1 min );72℃ 10 min。每批模板均同時進(jìn)行GAPDH的擴(kuò)增作為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀照相分析。

2 結(jié) 果

2.1總RNA濃度及純度 成功提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，總RNA濃度及純度符合RT-PCR反應(yīng)要求，可以進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。見表1。

2.2RT-PCR反應(yīng)結(jié)果 當(dāng)TGF-β濃度從0.25～2 ng/ml逐漸增加時，ZNF580的表達(dá)呈逐漸下降趨勢，但繼續(xù)增加TGF-β刺激濃度至4 ng/ml，ZNF580的表達(dá)則有所回升(圖1及表1)。

1～5泳道分別代表0.25、0.5、1、2、4 ng/ml TGF-β刺激組，對照組TGF-β刺激濃度為0 ng/ml

表1 總RNA的濃度、純度及內(nèi)皮細(xì)胞ZNF580基因相對表達(dá)量

3 討 論

近年來，AS所致心腦血管疾病的發(fā)病率逐年上升。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究人員已克隆出諸多和AS相關(guān)的基因。人ZNF580基因是以致動脈粥樣硬化因素-低密度脂蛋白(LDL)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，采用差異顯示逆轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)分析，以差異表達(dá)的ESTs為探針，篩選人主動脈cDNA文庫，得到的一個新基因(GenBank注冊號：AF184939)〔2〕。其cDNA 748-1266位堿基序列構(gòu)成一個完整的開放閱讀框架，編碼172個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。經(jīng)分子生物學(xué)網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析表明：其氨基端5-88位氨基酸序列為脯氨酸富含域，羧基端94-172位氨基酸序列中含有三個串聯(lián)重復(fù)的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，屬于C2H2型鋅指蛋白家族的新成員。目前認(rèn)為，C2H2型鋅指蛋白的主要生物學(xué)功能是作為真核生物中普遍存在的核轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。其在細(xì)胞分裂與增殖、器官分化、胚胎發(fā)育、脂代謝調(diào)節(jié)等生命過程中起著十分重要的作用〔6〕。

本課題組在前期的研究工作中利用酵母雙雜交技術(shù)篩選人胎腦cDNA文庫獲得了與鋅指蛋白ZNF580可能存在相互作用的多種蛋白，Smad2為其中之一。Smad2是轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵分子。有文獻(xiàn)顯示：TGF-β是一類多功能的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積的強(qiáng)大作用，而細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積伴隨著動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程。故TGF-β信號通路的活化可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)〔7，8〕。研究顯示：此信號通路的活化源于TGF-β與細(xì)胞表面的TGF-βⅡ、Ⅰ型受體的結(jié)合并形成配體-受體復(fù)合物，Ⅱ型受體通過磷酸化而激活Ⅰ型受體，Ⅰ型受體再磷酸化而激活細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Smads蛋白。Smad2屬于受體激活型Smads蛋白，可與Ⅰ型受體直接作用并被磷酸化?；罨腟mad2進(jìn)入細(xì)胞核，通過與其他轉(zhuǎn)錄因子及調(diào)節(jié)蛋白形成穩(wěn)定的蛋白-蛋白復(fù)合物而調(diào)控相應(yīng)靶基因的轉(zhuǎn)錄〔9〕。

本研究應(yīng)用不同濃度的TGF-β刺激內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)TGF-β濃度從0.25～2 ng/ml逐漸增加時，ZNF580的表達(dá)呈逐漸下降趨勢，但繼續(xù)增加TGF-β刺激濃度至4 ng/ml，ZNF580的表達(dá)又有所回升。上述結(jié)果表明：ZNF580很可能是受TGF-β信號通路調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子之一。其作用機(jī)制可能為：活化的Smad2轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，與ZNF580形成共作用因子，而使ZNF580的轉(zhuǎn)錄活性改變，二者共同發(fā)揮調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄的功能，并進(jìn)而參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為，并可能在AS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

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