盛樹東 王冬艷 張真穩(wěn) 史明儀

(揚州市職業(yè)大學醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009)

甘丙肽(GAL)廣泛分布于中樞和外周神經系統(tǒng)及其他組織，具有多種生物學功能。資料提示，GAL與胰島素功能存在內在聯(lián)系。GAL可抑制胰島素分泌，GAL基因敲除小鼠的胰島素分泌明顯增加〔1，2〕，但葡萄糖刺激胰島素分泌和胰島素降低血糖的作用卻顯著下降。表明沒有GAL的作用，胰島素促進葡萄糖攝取的功能下降；而GAL轉基因小鼠胰島素抵抗顯著下降，體重增加和糖脂代謝率提高〔3〕，提示GAL與細胞膜葡萄糖轉運蛋白(GLUT)4的葡萄糖轉運能力即胰島素敏感性之間存在一定關系。為了解GAL是否具有提高骨骼肌細胞胰島素敏感性和促進GLUT4膜轉位的作用，本實驗將運動作為促進GAL分泌的有效刺激〔4〕，運用GAL拮抗劑M35阻斷內源性GAL的作用，觀察大鼠正糖鉗的葡萄糖輸注速率、骨骼肌細胞GLUT4 mRNA水平和細胞外膜與內膜GLUT4數(shù)量的變化，以了解GAL是否在促進骨骼肌細胞GLUT4膜轉位的過程中發(fā)揮了作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選用64只220～250 g雄性Wistar健康大鼠，國標飼料喂養(yǎng)，自由飲食，室溫(24±2)℃。大鼠隨機分為4組，每組16只。安靜對照組和運動對照組腹腔注射生理鹽水0.3 ml/d，安靜用藥組和運動用藥組注射3 μmol·kg-1·d-1M35，連續(xù)20 d。兩運動組大鼠預游泳3 d，分別游15、30、50 min，正式游泳14 d，60 min/d，水溫(33±2)℃，水深50 cm。游泳前或相應時間進行注射。實驗第15天大鼠禁食8～10 h，稱重測血糖。每組8只大鼠用于血糖鉗實驗，另8只鼠麻醉后取股四頭肌，-70 ℃液氮保存。取血2 ml，加入肝素后4℃冰箱放置6 h，3 500 r/min離心10 min取血清，-20 ℃保存待測。

1.2實驗方法

1.2.1主要試劑與設備 M35(Sigma)、GLUT4一抗(ABCAM，英國)。EPS 2A200電轉運儀(Amersham biosciences 公司)、離心機(BECKMAN L7-55Ultracentrifuge 和 eppendorf Centrifuge 5415 D)、安穩(wěn)血糖儀(長沙三諾生物傳感技術公司)、捷達801分析系統(tǒng)(南京大學捷達科技公司)。

1.2.2正糖鉗實驗 采用改良Kraegen法〔5〕。大鼠用3%異戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉后，頸靜脈插入細硅管，將一三通管分別與靜脈插管、輸注胰島素的蠕動泵及輸注10%葡萄糖的蠕動泵相連。靜脈恒速輸注胰島素4 mU·kg-1·min-1，同時輸注10%葡萄糖液。每隔10 min測血糖，調節(jié)葡萄糖輸注速率至血糖穩(wěn)態(tài)，取穩(wěn)態(tài)下60 min內6次葡萄糖輸注速率和6次血糖均值納入統(tǒng)計。

1.2.3Western印跡法檢測骨骼肌細胞內膜和外膜GLUT4水平 用改良Kllip法分離細胞內外膜〔6〕。取后肢肌肉浸至0℃ 250 mmol/L Sucrose，50 mmol/L Tris 0.2 mmol/L EDTA溶液中，剪碎勻漿，離心10 min(4 ℃)，沉淀再勻漿離心共3次。取3次上清離心1 h(4 ℃)，取沉淀得細胞膜懸濁液-20℃保存。

取50 μg骨骼肌細胞外膜或內膜，在12%聚丙烯酰胺膠上經SDS-PAGE分離后，轉移于PVDF膜上，經10%脫脂奶粉封閉后，用GLUT4一抗孵育，洗脫后加入辣根過氧化物酶耦聯(lián)Ⅱ抗，用化學發(fā)光底物顯跡，檢測細胞內外膜GLUT4水平。外膜與內膜GLUT4濃度之和為細胞總膜GLUT4濃度。

1.2.4Real-time PCR法測定GLUT4 mRNA表達水平 取100 mg肌肉，用Trizol提取總RNA。GLUT4上游引物：5'-CAC TGG TCC TTG CTG TAT TC-3',下游引物：5'-CTG ATG TTA GCC CTG AGT G-3'，用RT-PCR試劑盒反轉錄。反應液體積25 μl，反應條件：94℃ 5 min 預變性;94℃ 45 s,55℃ 45 s,72℃ 1 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測GLUT4 mRNA表達水平。

1.2.5血清GAL水平檢測 按GALELISA試劑盒指示方法進行。

2 結 果

2.1血清GAL水平 實驗前4組GAL血清水平無顯著差異(F[3，28]=0.311，P>0.05)，實驗后有顯著變化(F[3，28]=21.2，P<0.01)。運動對照和運動M35組大鼠實驗后血清GAL水平比各自實驗前水平，及相應安靜對照實驗后水平均有顯著性提高(P<0.01)。見表1。

表1 大鼠血清GAL濃度運動前后變化

2.2正糖鉗實驗 安靜和運動M35組大鼠的葡萄糖滴注速率分別(20.03±2.74、40.75±4.28 mg·kg-1·min-1)低于安靜及運動對照組(24.62±3.61、54.67±4.64 mg·kg-1·min-1)約1/4(P<0.05,P<0.01)，而兩運動組的滴注速率分別高于各自安靜對照的2倍以上(P<0.01)。

2.3細胞GLUT4 mRNA表達水平測定 安靜和運動M35組實驗后GLUT4 mRNA相對豐度(0.114±0.021、0.214±0.027)均低于各自對照(0.241±0.023、0.582±0.071)(P<0.01)，而兩運動組均高于各自的安靜對照(P<0.01)。

2.4骨骼肌細胞膜GLUT4濃度測定 兩用藥組骨骼肌細胞外膜和總膜GLUT4水平均低于各自的對照組(P<0.05，P<0.01)，且兩用藥組細胞外膜GLUT4相對濃度與總膜濃度的比值也低于各自的對照組(15.4%vs 29.9%、18.9%vs 32.2%)，而兩運動組均高于各自的安靜對照(P<0.01)。見表2、圖1。

表2 M35對大鼠骨骼肌細胞外膜和總膜GLUT4相對濃度的作用

A安靜對照組，B運動對照組，C安靜M35組，D運動M35組

圖1GLUT4的Western印跡電泳圖

3 討 論

葡萄糖是通過易化擴散，經肌肉和骨骼肌細胞膜上的GLUT4幫助轉運進入細胞。糖尿病患者多數(shù)存在胰島素抵抗，導致胰島素絕對或相對不足，骨骼肌和脂肪對葡萄糖的攝取與利用減少，導致血糖升高。葡萄糖轉運能力與細胞膜GLUT4的數(shù)量呈正比〔1〕，細胞膜上GLUT4數(shù)量反映了胰島素的敏感性。資料顯示，運動可促進GAL表達和釋放。大鼠踏車鍛煉6 w后GAL mRNA水平顯著提高〔7〕。 Legakis等〔5〕也發(fā)現(xiàn)，中老年人鍛煉20 min后血清GAL濃度明顯升高，鍛煉停止15 min后達到峰值。本結果提示運動是促進GAL釋放的有效刺激。

文獻報道，瘦素、抵抗因子和神經激肽Y等可以影響胰島素敏感性〔8〕。本研究將GAL功能與胰島素敏感性聯(lián)系起來，探索兩者之間是否存在內在聯(lián)系。而骨骼肌細胞上存在GAL受體〔9〕，及GAL拮抗劑M35可降低胰島素敏感性提示存在這種可能性。

正糖鉗技術是定量分析胰島素敏感性的常用方法〔5〕。通過同時輸注可控濃度及速率的外源性胰島素和葡萄糖，打破體內葡萄糖對胰島素的負反饋調控。由于血清胰島素維持較高水平，抑制了內源性葡萄糖生成(糖原分解和糖異生)和胰島素分泌。調節(jié)外源性葡萄糖輸注速率，使血糖維持在穩(wěn)態(tài)水平，此時輸注的外源性葡萄糖等于體內各組織代謝的葡萄糖量。因此，正糖鉗的葡萄糖輸注速率反映了機體胰島素的敏感性。本研究正糖鉗實驗結果提示內源性GAL可以改善機體的胰島素敏感性。

葡萄糖跨膜轉運進入細胞需要細胞膜上糖轉運蛋白協(xié)助，目前發(fā)現(xiàn)14種分布及功能各不相同的糖轉運蛋白〔10〕，其中GLUT4是最主要的轉運體。GLUT4是胰島素敏感的蛋白，主要分布于肌肉和脂肪組織，是葡萄糖進入骨骼肌細胞主要載體。安靜時GLUT4主要儲存于胞漿囊泡中。在胰島素或運動刺激下，GLUT4從細胞內轉位至細胞膜上，將葡萄糖轉運進細胞內。運動后GLUT4轉運葡萄糖效率可提高1 040倍，以保證運動時向骨骼肌快速提供能量。因此，骨骼肌細胞膜上GLUT4含量反映了胰島素敏感性〔3〕。

本實驗結果提示M35不僅降低骨骼肌細胞GLUT4 mRNA表達水平和GLUT4濃度，而且抑制GLUT4從細胞內膜向細胞外膜的轉移。也即內源性GAL可提高骨骼肌細胞GLUT4 mRNA和GLUT4水平，促進GLUT4膜位移，提高機體胰島素敏感性。所以，GAL是除胰島素之外，調節(jié)機體胰島素敏感性的又一重要激素。GAL有3種亞型受體，GAL主要通過什么亞型受體發(fā)揮調節(jié)胰島素敏感性的作用，尚待今后進一步探討。

4 參考文獻

1Konrad D,Bilan PJ,Nawaz Z,etal.Need for GLUT4 activation to reach maximum effect of insulin-mediated glucose uptake in brown adipocytes isolated from GLUT4 myc-expressing mice〔J〕.Diabetes,2002;51:2719-26.

2Ahren B,Pacini G,Wynick D,etal.Loss of function mutation of the galanin gene is associated with perturbed islet function in mice〔J〕.Endoc，2004；145:3190-6.

3Poritsanos NJ,Mizuno TM,Lautatzis ME,etal.Chronic increase of circulating galanin levels induces obesity and marked alterations in lipid metabolism similar to metabolic syndrome〔J〕.Int J Obes,2009;33:1381-9.

4Legakis IN，Mantzouridis T，Saramantis A，etal.Human galanin secretion is increased upon normal exercise test in middle-age individuals〔J〕.Endocr Res,2000;26(3):357-64.

5Legalkis IN,Mantzouridis T,Mountokalakis T.Positive correlation of galanin with glucose in healthy volunteers during an oral glucose tolerance test〔J〕.Horm Metab Res,2007;39:53-5.

6Kristiansen S,Ramlal T,Klip A.Phosphatidylinositol 4-kinase,but not phosphatidylinositol 3-kinase,is present in GLUT4-containing vesicles isolated from rat skeletal muscle〔J〕.Biochem J,1998;335:351-6.

7O’Neal HA,Van H JD,Holmes PV,etal.Prepro-galanin messenger RNA levels are increased in rat locus coeruleus after treadmill exercise training〔J〕.Neurosci Lett,2001;299(16):69-72.

8Hohmann JG,Teklemichael DN,Weinshenker D,etal.Obesity and endocrine dysfunction in mice with deletions of both neuropeptide Y and galanin〔J〕.Mol Cell Biol,2004;24:2978-85.

9Holmberg K,Kuteeva E,Brumovsky P,etal.Generation and phenotypic characterization of a galanin overexpressing mouse〔J〕.Neurosci,2005;133:59-77.

10Augustin R.The protein family of glucose transport facilitators：It's not only about glucose after all〔J〕.Iubmb Life,2010;62:315-33.