白輝英 馮 星 孫 明 王曉蘭

(吉林市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，吉林 吉林 132001)

持續(xù)血流動(dòng)力學(xué)異常造成心臟長(zhǎng)期負(fù)荷過(guò)重可導(dǎo)致心室重塑。心肌重塑是一個(gè)多因素相互作用的連續(xù)過(guò)程，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)介導(dǎo)的信號(hào)通路在心室重塑中起重要作用〔1〕，抑制CaN活性可阻斷與心室重塑有關(guān)的細(xì)胞和分子事件。本實(shí)驗(yàn)研究他克莫司(FK506)在心肌梗死后心力衰竭形成過(guò)程中的作用，尋找心肌梗死后心力衰竭藥物治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 兩月齡雄性SD大鼠，體重(300±30)g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2急性心肌梗死(AMI)模型建立 SD大鼠經(jīng)20%烏拉坦5 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，背位固定于手術(shù)臺(tái)上，無(wú)菌操作下沿大鼠左腋下與胸骨劍突連線(xiàn)處切開(kāi)皮膚，逐層鈍性分離肌肉，將面罩罩住大鼠口鼻連接人工呼吸機(jī)(參數(shù)設(shè)定為：呼吸比1∶2，潮氣量8～12 ml，呼吸頻率75～80，壓力1.5～2.5 kPa)，沿4、5肋間開(kāi)胸，分離心包膜，擠出心臟至可見(jiàn)肺動(dòng)脈圓錐，以0號(hào)線(xiàn)于左心耳根部下方2 mm處進(jìn)針，在肺動(dòng)脈圓錐旁出針，深度為0.3～0.5 mm結(jié)扎LAD，心臟復(fù)位后迅速擠出空氣關(guān)閉胸腔，制造胸腔負(fù)壓狀態(tài)，縫合肌肉皮膚。假手術(shù)對(duì)照組在相同條件下穿過(guò)針線(xiàn)后不結(jié)扎。術(shù)后測(cè)定Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以心電圖作為大鼠AMI納入標(biāo)準(zhǔn)，若術(shù)后心電圖ST段抬高較術(shù)前未超過(guò)0.2 mV且QRS波群無(wú)明顯變化，則為造模型失敗。

1.3實(shí)驗(yàn)分組 術(shù)后24 h存活，且模型成功的大鼠采用隨機(jī)方法分為control組、control+FK506組、假手術(shù)組(sham組)、模型組(model組)、model+FK506組，每組10只。

1.4給藥 FK506由安斯泰來(lái)制藥(中國(guó))有限公司提供，批號(hào)1D5520A，用生理鹽水配置。篩選AMI模型后，將模型成功大鼠按0.3 mg/kg、5 ml/kg體積灌胃，1次/d，連續(xù)30 d。control組和sham組每日按5 ml/kg體積灌生理鹽水。

1.5心臟超聲檢查 給藥4 w后大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后，用彩色多普勒超聲診斷儀(APOGEE3500)，采用15L8w探頭，探頭頻率為14 MHz。左室短軸圖像在乳頭肌水平獲得，左室長(zhǎng)軸圖像通過(guò)垂直于短軸獲得，舒張末期定義為左室容積最大時(shí)，收縮末期定義為左室容積最小時(shí)，測(cè)量左室長(zhǎng)軸和左室短軸乳頭肌水平M型曲線(xiàn)，SWEEP 100～200 mm/s，共測(cè)5個(gè)心動(dòng)周期。測(cè)量左室內(nèi)徑、左室容量、左心功能、左心重量、左房?jī)?nèi)徑、室間隔和左室后壁收縮期與舒張期厚度及收縮期增厚百分比等指標(biāo)。在胸骨旁左室短軸乳頭肌水平，用DTI-PW測(cè)定的左室前壁與左室后壁心肌運(yùn)動(dòng)頻譜，記錄主波Sm、Em、Am的峰值速度。

1.6大鼠心肌梗死重量指數(shù) 4 w后取心臟，生理鹽水沖洗去血污，剔除血管、脂肪等非心肌組織，用濾紙吸出水分，沿冠狀溝切除心房和右心室，留下左心室。順?lè)渴覝蠌男募獾叫氖业撞科叫袑⒆笮氖仪谐?.1 cm厚的心肌片。切片后將左心室放在0.2%NBT溶液中37℃水浴環(huán)境染色5 min，梗死區(qū)域呈現(xiàn)未染色的灰白色，未梗死區(qū)域呈現(xiàn)NBT與脫氫酶反應(yīng)后的藍(lán)色，切下灰白色區(qū)域稱(chēng)重即為梗死心肌重量，稱(chēng)取非梗死心肌重量，用梗死心肌重量/左心室重量，即為梗死重量指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1大鼠生存情況 術(shù)后model組死亡3只，model+FK506組死亡1只，余納入實(shí)驗(yàn)大鼠均存。

2.2心肌梗死面積改變情況 術(shù)后4 w model組與sham組比較，心臟指數(shù)差異顯著(P<0.05)；model組與給藥組比較，心臟指數(shù)差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 心肌梗死面積

與sham組比較：1)P<0.05；與model組比較：2)P<0.05

2.3心臟超聲改變情況 model組與sham組比較，左心室前壁運(yùn)動(dòng)減弱，左心室射血分?jǐn)?shù)明顯減弱(P<0.05)；術(shù)后4 w心臟超聲檢查可見(jiàn)給藥組可降低左心室前壁運(yùn)動(dòng)減弱及左心室射血分?jǐn)?shù)減弱趨勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 術(shù)后4 w大鼠心臟功能比較

3 討 論

心肌梗死動(dòng)物模型的制作方法有多種，早期國(guó)外多采用Johns法，即在自主呼吸條件下，不用呼吸機(jī)支持，迅速開(kāi)胸?cái)D出心臟行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎。這種方法需要在極短時(shí)間內(nèi)完成，技術(shù)要求高，難度大，且由于心臟移位，容易導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)紊亂和心律失常等并發(fā)癥，開(kāi)胸后大鼠呼吸無(wú)法保證，因而手術(shù)死亡率極高。此后，F(xiàn)isbein等在Johns法基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，應(yīng)用小動(dòng)物呼吸機(jī)維持呼吸，明顯提高了手術(shù)的成活率〔2〕。

本實(shí)驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便，可在開(kāi)胸后為冠狀動(dòng)脈結(jié)扎贏得更多時(shí)間，術(shù)后呼吸道并發(fā)癥少。而且本實(shí)驗(yàn)以眼科開(kāi)瞼器充分撐開(kāi)肋間肌切口，不但手術(shù)視野清晰，而且避免心臟移位和血流動(dòng)力學(xué)紊亂，明顯減少心肌損傷和心律失常的發(fā)生。

本研究采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支的方法構(gòu)建心力衰竭模型，其優(yōu)點(diǎn)在于有一定的臨床發(fā)病擬似性，可較好地模擬心肌缺血性心力衰竭。本研究中，心肌梗死造成心肌細(xì)胞嚴(yán)重缺血，營(yíng)養(yǎng)及能量代謝障礙，心肌收縮力下降，心排血量明顯減少，進(jìn)而加重總心臟負(fù)荷，導(dǎo)致惡性循環(huán)，發(fā)展為心力衰竭。造模4 w后，大鼠心臟左室前壁可見(jiàn)瘢痕組織，超聲心動(dòng)圖示梗死區(qū)心肌運(yùn)動(dòng)減弱，射血分?jǐn)?shù)減低。血流動(dòng)力學(xué)檢查示收縮和舒張功能下降。提示急性心肌梗死動(dòng)物模型建立成功，實(shí)驗(yàn)中心肌梗死面積在35%～45%，表明實(shí)驗(yàn)均一性良好。

正常情況下，肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)在調(diào)節(jié)心肌收縮和舒張中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)K506可降低大鼠心肌梗死后心力衰竭心肌的減弱趨勢(shì)，對(duì)衰竭心肌的左室功能有改善作用。FK506是CaN抑制劑，CaN是一種鈣離子敏感的蛋白磷酸酶，可被細(xì)胞內(nèi)持續(xù)升高的Ca2+濃度激活，使磷酸化的蛋白去磷酸化〔3，4〕。所以，當(dāng)心力衰竭發(fā)生時(shí)，衰竭心肌收縮力下降，與肌漿網(wǎng)上鈣離子釋放量明顯下降有關(guān)。給予CaN抑制劑FK506，F(xiàn)K506與CaN底物結(jié)合，阻止了舒張期鈣的滲漏，抑制了心力衰竭的進(jìn)展〔5〕。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FK506可降低大鼠心肌梗死后心力衰竭心肌的減弱趨勢(shì)，對(duì)衰竭心肌的左室功能有改善作用。梗死后心力衰竭過(guò)程中發(fā)生心肌重塑與CaN通路有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

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4Nagata K，Somuta F，Obata K，etal.AT1 receptor blochade reduces cardiac calcineurin activity in hypertensive rats〔J〕.Hypertension，2002;40(2)：168.

5Hasenfuss G.Pieske B.Calcium cycling in congestive heart failure〔J〕.J Mol Cell Cardiol，2002;34：951-69.