姜 晶 王彩芹 劉楠楠

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，吉林 吉林 132011)

結(jié)締組織生長因子(CTGF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的生長因子，具有介導(dǎo)細(xì)胞黏附、刺激細(xì)胞遷移 、 促進(jìn)血管形成等作用，但是其最重要的功能為刺激成纖維細(xì)胞增殖和膠原沉積，促進(jìn)肉芽組織形成及促纖維化等。目前研究表明CTGF異常表達(dá)在糖尿病腎病(DN)纖維化過程中起著至關(guān)重要的作用〔1〕。糖尿病引起腎小球硬化是DN產(chǎn)生的主要機(jī)制，目前認(rèn)為CTGF是腎小球硬化過程中重要的生長因子〔2〕。本實(shí)驗(yàn)觀察貝那普利對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎臟CTGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 Wistar大鼠34只，雌雄不限，體重197～255 g，由吉林省藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科提供，血糖正常。隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=10)、糖尿病模型組(n=12)、貝那普利組(n=12)。實(shí)驗(yàn)期間室溫控制在18～20℃，相對(duì)濕度50%，12 h交替照明，大鼠自由進(jìn)食、飲水，保持墊料干燥。

1.2動(dòng)物模型的建立及給藥 將鏈脲佐菌素(STZ)溶于0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液中，模型組及貝那普利組大鼠腹腔注射65 mg/kg STZ緩沖液，對(duì)照組動(dòng)物只注射等量檸檬酸緩沖液。72 h后尾尖靜脈采血測(cè)定空腹血糖，當(dāng)血糖≥16.7 mmol/L，尿糖>，動(dòng)物出現(xiàn)多飲、多食與多尿等臨床表現(xiàn)確定為糖尿病大鼠。次日貝那普利組給予貝那普利按10 mg·kg-1·d-1灌胃，每日一次，連續(xù)灌服12 w。對(duì)照組和模型組給等量自來水灌胃。實(shí)驗(yàn)期間，大鼠自由進(jìn)食、飲水，不給胰島素等降糖藥物進(jìn)行治療。

1.3主要試劑和藥品 鏈脲佐菌素(STZ)為美國Sigma公司產(chǎn)品，貝那普利由北京諾華公司制造，血糖高靈敏度試劑盒(長春匯力生物工程技術(shù)有限公司)，尿葡萄糖檢測(cè)試紙片(桂林中輝生物技術(shù)有限公司)，尿白蛋白酶免疫法試劑盒(上海德波生物技術(shù)有限公司)。SP試劑盒及胃蛋白酶(福州邁新生物技術(shù)有限公司)，羊抗人CTGF-C末端抗體(1：100，R&D公司)。

1.4標(biāo)本收集及處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 w(第11周末)，將大鼠放入代謝籠，禁食，收集并記錄24 h尿量，離心，-80℃冰箱保存。于實(shí)驗(yàn)第12周末，在麻醉下眶后采血，處死大鼠后，迅速取雙側(cè)腎臟，清洗吸干后稱重，經(jīng)腎門冠狀面取組織，置于10%甲醛液中固定。用日立7150型自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血和尿的各項(xiàng)生化指標(biāo)。

1.5免疫組化檢查 將10%甲醛液固定的腎組織塊制成厚4 μm的切片，常規(guī)脫蠟、水化。按SP法試劑盒操作步驟進(jìn)行，一抗為抗鼠CTGF-C末端抗體(1：100)，經(jīng)胃蛋白酶室溫下消化20 min后，與一抗工作液37℃下孵育1 h，形成的復(fù)合物與3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)反應(yīng)，顯色，顯微鏡下監(jiān)視，呈紅色陽性為止，蘇術(shù)素復(fù)染、脫水、透明、封片。用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。使用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行免疫組織化學(xué)半定量分析：光鏡下高倍視野觀察每個(gè)標(biāo)本，在腎皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)選取20個(gè)視野，陽性染色的部位及深淺以平均光密度值表示。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組動(dòng)物血糖、體重、腎重及腎重/體重變化 腹腔注射STZ后，大鼠血糖逐漸升高，而體重減輕，說明糖尿病模型建立成功。糖尿病模型組有4只死亡，貝那普利組有3只死亡。12 w末時(shí)貝那普利組大鼠與糖尿病模型組比較空腹血糖降低不顯著、腎重輕微降低(P>0.05)，體重上升顯著，腎重/體重明顯下降(P<0.01)，見表1。

2.2各組大鼠尿素氮、血肌酐、尿白蛋白排泄率變化 12 w末時(shí)模型組大鼠尿素氮、血肌酐及尿白蛋白排泄率(UAER)升高，與對(duì)照組有顯著差異(P<0.01)；與模型組比較，貝那普利組上述各項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降(P<0.01)。見表2。

表1 各組空腹血糖、體重、腎重、腎重/體重結(jié)果

表2 各組尿素氮、血肌酐、UAER、尿總蛋白測(cè)定結(jié)果

2.3各組CTGF的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色顯示，CTGF陽性染色主要分布在腎小球上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞及系膜區(qū)和腎小管基膜。對(duì)照組腎小球、腎小管僅呈微弱表達(dá)，染色淺淡。而模型組CTGF表達(dá)呈強(qiáng)陽性。見圖1。半定量分析結(jié)果表明，模型組腎CTGF陽性染色百分比(66.4%±12.51%)顯著高于對(duì)照組(23.1%±3.55%)(P<0.05)；而貝那普利組(31.6%±8.93%)顯著低于模型組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠CTGF表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)

3 討 論

CTGF對(duì)組織促纖維化效應(yīng)明顯，可促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)合成增加〔3〕。而腎小球肥大是DN早期比較特征性的改變，CTGF參與了DN發(fā)生發(fā)展多個(gè)環(huán)節(jié)〔4，5〕。在大鼠和人腎纖維化中，CTGF可能介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)致病效應(yīng)〔6，7〕。但轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β作用廣泛，除誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和促進(jìn)組織纖維化外，還有抗炎和抗細(xì)胞分化等功能〔8〕，因此長期阻斷TGF-β，可能產(chǎn)生不良后果。但CTGF的作用相對(duì)單一，可能僅介導(dǎo)TGF-β的部分生物學(xué)效應(yīng)，如刺激細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成，在促進(jìn)組織器官纖維化方面發(fā)揮重要作用，并不參與TGF-β抗炎等生物學(xué)作用〔9〕。因此，CTGF可能是更特異的DN所引起腎纖維化的治療靶點(diǎn)，并已成為這一研究領(lǐng)域中新的熱點(diǎn)。CTGF在腎臟表達(dá)尤為豐富，其過度表達(dá)，可促進(jìn)腎臟細(xì)胞外基質(zhì)累積、腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化，在DN腎臟肥大和纖維化中起重要作用〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示貝那普利對(duì)DN大鼠腎臟具有良好的抗纖維化作用?？傊?，在高血糖刺激下，多種腎組織細(xì)胞如腎小球上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管基膜異常分泌CTGF，促進(jìn)細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)積聚，從而參與DN性腎小球硬化的發(fā)生、發(fā)展。與此相反，CTGF在正常生理狀態(tài)下表達(dá)水平較低，生物效應(yīng)較單一，阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性，可能是一種更特異、更有效地防治DN性腎小球硬化癥的手段。貝那普利能有效抑制CTGF的表達(dá)，但通過何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，有待深入探討。

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