代立娟 韓有文 李紹民 徐偉麗 李春媚 朱 有 馮 瀾

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染病科，黑龍江 佳木斯 154002)

呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼兒和小年齡兒童急性下呼吸道感染常見的病原，幾乎所有2歲以下的兒童都感染過RSV病毒〔1〕。近年來又發(fā)現(xiàn)RSV是感染老年人和免疫抑制成人的重要病毒。對(duì)RSV的預(yù)防目前仍然缺少有效的藥物和疫苗。肉桂醛是一種有機(jī)化合物，肉桂油的主要成分，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗突變等多種藥理作用，且毒副作用小。先期試驗(yàn)已經(jīng)證明肉桂醛有抗RSV的作用，但具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究〔2〕。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討肉桂醛抗RSV過程中對(duì)宿主細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1材料 RSV株，Hela細(xì)胞株由佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室保存；肉桂醛購買于美國sigma公司、1640培養(yǎng)液(Invitrogen公司)，四季青牌胎牛血清；兔源Bcl-2蛋白多克隆抗體(美國Santa公司)、兔源Bax 蛋白多克隆抗體和FITI標(biāo)記羊抗兔IgG抗體均購買于美國Santa公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將Hela細(xì)胞接種在10%的細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中1～2 d更換細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長約80%以上時(shí)胰酶消化進(jìn)行傳代，直至所需要細(xì)胞量。

1.3病毒收集接種病毒毒力測定 Hela細(xì)胞培養(yǎng)成70%后，接種RSV液，繼續(xù)培養(yǎng)當(dāng)病變達(dá)到75%時(shí)經(jīng)過三凍三融收集放低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4肉桂醛配制 用2%細(xì)胞維持液將肉桂醛進(jìn)行不同濃度稀釋再用濾器過濾備用。

1.5接種病毒毒力測定 將Hela細(xì)胞接種于96孔板待細(xì)胞長成單層，將已經(jīng)稀釋好的不同濃度的病毒液每一個(gè)濃度重復(fù)8孔，并設(shè)陰性對(duì)照組和正常細(xì)胞組，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)細(xì)胞變性效果(CPE)結(jié)果變化用Reed-Muench法計(jì)算CCID50。

1.6肉桂醛對(duì)Hela細(xì)胞毒性測定

1.6.1對(duì)RSV病毒的直接滅活作用 將Hela細(xì)胞接種至放有蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理的6孔板中長成約70%備用，將低(0.078 1 mg/mg)、中(0.156 3 mg/mg)、高濃度(0.312 5 mg/mg)的肉桂醛與病毒液等量混勻，置37℃溫箱2 h。棄6孔板中培養(yǎng)液。每孔加入不同濃度混合液，設(shè)病毒對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照，置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液，加入細(xì)胞維持液，觀察細(xì)胞變化，免疫熒光染色處理，激光共聚焦檢測。

1.6.2對(duì)RSV病毒的吸附作用 將Hela細(xì)胞接種至放有蓋玻片經(jīng)多聚賴氨酸處理的6孔板中長成約70%備用，將低、中、高濃度的肉桂醛與病毒液等量混勻，棄六孔板中培養(yǎng)液。每孔加入低、中、高濃度肉桂醛與病毒混合液，設(shè)病毒對(duì)照，正常細(xì)胞對(duì)照，置37℃溫箱2 h，棄混合液病毒液，加入2%細(xì)胞維持液，觀察細(xì)胞變化，免疫熒光染色處理，共聚焦檢測。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1肉桂醛無毒濃度測定 在一定范圍內(nèi)肉桂醛濃度降低使其對(duì)細(xì)胞毒性降低，細(xì)胞活力逐漸增強(qiáng)，試驗(yàn)計(jì)算得出肉桂醛的有效無毒濃度范圍為0.156 3～0.312 5 mg/ml。

2.2RSV毒力 在病毒對(duì)照組細(xì)胞病變達(dá)到75%時(shí)，電鏡下50%細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)變化時(shí)認(rèn)為CPE陽性。用Reed-Muench法計(jì)算得CCID50為106.65，本實(shí)驗(yàn)中100CCID50/100 μl病毒攻擊量為104.65。

2.3宿主Hela細(xì)胞Bcl-2蛋白熒光表達(dá)量的測定 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示各組細(xì)胞內(nèi)均可見不同強(qiáng)度的熒光，經(jīng)藥物干預(yù)后和病毒感染組相比Bcl-2的表達(dá)量明顯增強(qiáng)，細(xì)胞存活率增加。見表1，圖1。

表1 各組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)

2.4宿主Hela細(xì)胞Bax 蛋白熒光表達(dá)量的測定 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示各組細(xì)胞內(nèi)均可見不同強(qiáng)度的熒光，經(jīng)藥物干預(yù)后和病毒感染組相比Bax的表達(dá)量明顯降低，細(xì)胞存活率增加。見表2，圖2。

表2 各組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)

正常組直接滅活

病毒組直接滅活

中濃度直接滅活

中濃度吸附

正常組直接滅活

病毒組直接滅活

中濃度直接滅活

中濃度吸附

3 討 論

RSV是一種嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物。感染病毒的細(xì)胞凋亡，對(duì)于病毒的大量復(fù)制無益。從這種病毒和細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系來看，細(xì)胞凋亡是機(jī)體主動(dòng)防御應(yīng)對(duì)病毒感染的一種方式。RSV感染細(xì)胞后，源于內(nèi)在的蛋白產(chǎn)物直接作用于細(xì)胞，與凋亡有關(guān)的因子及蛋白水解酶誘導(dǎo)發(fā)生凋亡。宿主細(xì)胞受到病毒攻擊后，發(fā)生凋亡可能是機(jī)體針對(duì)外來病毒侵入采取的保護(hù)機(jī)制之一。一些病毒感染性疾病的發(fā)展與細(xì)胞凋亡規(guī)律失常有關(guān)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞為維持自身內(nèi)環(huán)境平衡，細(xì)胞自發(fā)的保護(hù)性死亡過程。已證實(shí)的主要凋亡調(diào)控基因分為兩大類，即凋亡抑制基因Bcl-2和凋亡促進(jìn)基因Bax。這兩大類基因相互作用的結(jié)果共同決定細(xì)胞的生存與死亡走向〔3〕。Bcl-2 基因蛋白家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用〔4〕，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡調(diào)控的最后通路之一。其主要分布于核膜、線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等部位。Bcl-2 蛋白可通過拮抗野生型 P53 蛋白的促凋亡作用，抑制多種因素誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。Bax 作為 Bcl-2 的同源體，抑制 Bcl-2 作用，其與 Bcl-2 基因一樣在組織廣泛表達(dá)〔5〕。

Bax 過量時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Bcl-2 過量時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。已完成的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)肉桂醛具有抗RSV作用〔6〕。細(xì)胞受病毒感染后的命運(yùn)轉(zhuǎn)歸涉及許多生理和病理過程。最終是什么機(jī)制在這個(gè)高度復(fù)雜、精確控制的過程起核心作用，從以上實(shí)驗(yàn)可以看出，Bcl-2和Bax之間的動(dòng)態(tài)平衡，可能是決定細(xì)胞生死的核心機(jī)制之一。相信隨著深入研究Bcl-2/Bax的比率，將在疾病的診斷和治療中發(fā)揮越來越重要的作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Harker JA，Yamaguchi Y，Culley FJ，etal.Delayed sequelae of neonatal RSV infection are dependent on cells of the innate immune system〔J〕.J Virol,2014;88(1):604-11.

2Theurer M，Shaik N，Lang F.Stimulation of suicidal erythrocyte death by transcinnamaldehyde〔J〕.Phytomedicine,2013；20(12)：1119-23.

3Tailor D，Hahm ER，Kale RK，etal.Sodium butyrate induces DRP1-mediated mitochondrial fusion and apoptosis in human colorectal cancer cells〔J〕.Mitochondrion,2013;s1567-7249(13)00255-9.

4Zhu M，Hong D，Bao Y，etal.Oridonin induces the apoptosis of metastatic hepatocellular carcinoma cells via a mitochondrial pathway〔J〕.Oncol Lett,2013；6(5)：1502-6.

5Zaman F，Chrysis D，Huntjens K，etal.Dexamethasone differentially regulates Bcl-2 family proteins in human proliferative chondrocytes：role of pro-apoptotic Bid〔J〕.Toxicol Lett,2014;224(2):196-200.

6代立娟，王 琳，馮 瀾.肉桂醛抗呼吸道合胞病毒的作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2013;33(6):1309-12.