薛端陽 張 潔 汪曉鶯 馬 艷 魏煒煒

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南通 226019)

血管擬態(tài)(VM)是指具有高度侵襲性的腫瘤細胞可以通過自身的伸展、變形形成血管樣細胞，這種腫瘤的特點就是具有高度可塑性。VM已在多種類型的腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，而往往VM的發(fā)生都與不良的預(yù)后相關(guān)，可能受相關(guān)修飾酶的表遺傳調(diào)控。LSD1是一種重要的表遺傳調(diào)控酶類，具有組蛋白H3第4位賴氨酸二位去甲基化酶活性〔H3K4(2m)〕和組蛋白H3第9位賴氨酸去甲基化(H3K9)酶活性，從結(jié)構(gòu)上來看，LSD1的C端2/3區(qū)域與FAD依賴性胺氧化酶有高度的序列同源性，其N端含一個SWIRM結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是蛋白-蛋白相互作用基序。SWIRM結(jié)構(gòu)域使得LSD1及其家族與傳統(tǒng)的胺氧化酶有所不同，在生物發(fā)育中扮演著重要的角色。目前LSD1在腫瘤發(fā)生中的研究主要集中在對細胞增殖生長的影響，尚未見到LSD1對于相關(guān)腫瘤細胞形成VM能力的報道。本文初步探討LSD1分子在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移上的作用。

1 材料與方法

1.1試劑及主要儀器 RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Trypsin) 、胎牛血清(FBS) 購自北京鼎國生物有限公司；MTT、二甲基亞砜(DMSO) 為天津化學(xué)試劑二廠產(chǎn)品；余為國產(chǎn)分析醇。二氧化碳培養(yǎng)箱為日本SANYO 公司產(chǎn)品。An Thos TH2酶標儀為Austria公司生產(chǎn)。

1.2細胞培養(yǎng)和MTT 缺氧和對照組的人卵巢癌細胞株SKOV3 在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48小時換液1次，0.25% 的胰蛋白酶消化傳代，細胞單層貼壁生長，選擇對數(shù)生長期細胞實驗。將SKOV3細胞株分為對照組、缺氧組。對照組為未處理的SKOV3細胞株。采用MTT法測定72 h的細胞增殖的抑制效率，用0.25%的胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的細胞株SKOV3，制成4×104/ml細胞懸液，以每孔200 μl接種于兩個96孔板。采用全自動酶標儀測定每孔的492 nm吸光度OD值。計算細胞存活率和抑制率。

1.3細胞缺氧誘導(dǎo) 將接種的細胞置于GENbox Jar2.5L厭氧盒中，持續(xù)充以混合氣體(5%CO2+1%O2+94%N2)，壓力為0.1 mPa，氣體從容器的另一孔排出，模擬1%CO2的缺氧環(huán)境。

1.4Matrigel膠三維培養(yǎng) 將Matrigel與RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液(含OVCAR-3細胞數(shù)約1×104)按1∶3混合，滴入24孔培養(yǎng)板，每孔150 μl，37℃孵育30 min凝膠，建立Matrigel膠三維培養(yǎng)系統(tǒng)，將對數(shù)生長期OVCAR-3(每孔1×105個)單細胞懸液接種于Matrigel三維培養(yǎng)系統(tǒng)，分別在常氧(常氧組)、缺氧(1%O2，缺氧組)等條件下培養(yǎng)。每隔48 h換液，培養(yǎng)7 d，相差顯微鏡動態(tài)觀察擬態(tài)血管形成情況并攝片。

1.5Western印跡檢測細胞中LSD1表達和H3K4(2m)去甲基化酶活性 取常氧和缺氧條件下培養(yǎng)7 d的OVCAR-3細胞，每孔加入細胞裂解液500 μl， 輔以細胞刮刀于冰上裂解細胞，0℃離心5 000 r/min×10 min，取上清，-80 ℃凍存。SDS-PAGE凝膠電泳，Western印跡檢測蛋白質(zhì)，一抗山羊抗人(LSD1，山羊抗人H3K4(2m)1∶1 000；GAPDH，1∶2 000)，將轉(zhuǎn)印膜放入用10%脫脂奶粉的TBST稀釋的HRP耦聯(lián)的二抗(1∶750)中，洗膜、顯影和定影。

2 結(jié) 果

2.1缺氧條件下Matrigel三維培養(yǎng)OVCAR-3細胞形成VM 利用Matrigel膠三維培養(yǎng)觀察VM的形成情況。常氧條件下， OVCAR-3細胞雖能出現(xiàn)長條形伸展或細胞質(zhì)有多個突起，部分表現(xiàn)出條索狀和不規(guī)則橢圓形等改變，但不能形成上述管道樣結(jié)構(gòu)。缺氧條件培養(yǎng)下， OVCAR-3細胞浸潤在Matrigel上疊加生長，隨著缺氧時間的延長，部分細胞逐漸伸展、變形，呈長條形或弧形，7 d后細胞與細胞之間開始相互連接，并能形成腔樣、管狀、分支和網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)等脈管樣改變。見圖1。

圖1 缺氧對Matrigel三維培養(yǎng)6 d OVCAR-3細胞形態(tài)的影響(×200)

2.2缺氧條件下OVCAR-3細胞LSD1的表達及酶活性檢測 取常氧和缺氧條件下培養(yǎng)7 d的OVCAR-3細胞，用Western印跡檢測LSD1及H3K4的水平(圖2)。缺氧條件刺激下，LSD1的表達有明顯的升高(2.91±0.2)(P=0.000)。為了說明LSD1的主要酶活性的升高，同時檢測H3K4(2m)的水平，實驗證明H3K4的相對水平隨著LSD1升高而降低(0.22±0.03)(P=0.017)，兩組間有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 缺氧對OVCAR-3細胞LSD1表達和H3K4(2)水平的影響

2.3缺氧條件下OVCAR-3細胞的生長狀態(tài) 倒置顯微鏡下，對照組和缺氧組的SOVAR-3 細胞均呈現(xiàn)，貼壁良好、形態(tài)梭形、胞核橢圓、胞漿透亮的狀態(tài)(圖3)。細胞培養(yǎng)72 h后，MTT 法測定SKOV-3細胞增殖的抑制作用，計算細胞抑制率，對照組和缺氧組分別是(1.32±0.01)，(1.34±0.01)(P=0.062)，兩組間無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 缺氧對培養(yǎng)4 d OVCAR-3細胞角形態(tài)影響(×400)

3 討 論

侵襲轉(zhuǎn)移是癌細胞從原發(fā)性部位轉(zhuǎn)移到遠端部位形成腫瘤的過程，它是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和影響預(yù)后的重要因素。多數(shù)癌癥都有侵襲轉(zhuǎn)移的風險。而浸潤轉(zhuǎn)移是也是晚期食管癌重要死因。1999年，VM在在具有高度侵襲型的葡萄膜黑色素瘤中被發(fā)現(xiàn)〔1〕。VM獨特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)類似與胚胎的血管網(wǎng)絡(luò)。而兩者結(jié)構(gòu)的相似性被認為是具有高度浸潤性的腫瘤細胞具有類似與胚胎樣表型的分化潛能。基因表達研究揭示具有分化為VM的能力的高度侵襲性的黑色素瘤的基因表達與包括上皮細胞，內(nèi)皮細胞，成纖維細胞特性在內(nèi)的多細胞表型有關(guān)〔2，3〕。

VM形成的“原動力”腫瘤細胞的缺氧狀態(tài)。在缺氧狀態(tài)下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它在血管形成、細胞增殖、能量代謝、紅細胞生成、細胞黏附等相關(guān)基因的調(diào)控方面均占很重要的地位。在某些腫瘤(卵巢癌、宮頸癌等婦科實體瘤)發(fā)生過程中，缺氧是微環(huán)境的基本特征之一，作為一種應(yīng)激原可以激活腫瘤細胞內(nèi)一系列基因?qū)Φ脱鯛顟B(tài)做出應(yīng)答反應(yīng)，并通過多條途徑使缺氧相關(guān)因子的表達增多。有研究顯示VM可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、EphA2等血管生成基因表達上調(diào)〔4，5〕。這些分子及其配體對血管的生成和維持極其重要〔6〕。VM形成后可以使腫瘤細胞獲得供氧，最終導(dǎo)致血液循環(huán)〔1，7〕。

參與可塑性腫瘤細胞形成VM的各種分子，而并不依賴某一條分子信號通路，這可以解釋為什么不同的腫瘤細胞在形成擬態(tài)血管時表達不同的VM相關(guān)基因，一些基因的“開或關(guān)”受表遺傳修飾控制。自從Strahl 和Allis提出“組蛋白密碼”假說后，組蛋白修飾逐漸成為表遺傳領(lǐng)域研究的熱點。2004年，第一個組蛋白賴氨酸去甲基化酶LSD1被發(fā)現(xiàn)〔8〕。LSD1發(fā)揮著重要的生理功能并與很多疾病有密切的關(guān)系〔9，10〕。在很多腫瘤細胞增殖生長過程中，LSD1表現(xiàn)出“原癌基因”的特性。令人感興趣的是：本實驗發(fā)現(xiàn)LSD1分子在缺氧條件下表達上升，SKOV-3細胞的增殖能力缺未受影響。這也提示LSD1分子并不促進卵巢癌細胞增殖。

Wang等〔11〕的研究曾發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，研究LSD1可以形成NuRD復(fù)合物的一個亞單位，控制乳腺癌細胞遷移能力。在此過程中，LSD1行使H3K4(2m)去甲基化酶活性，啟動了下游基因的開啟。但是目前尚未見LSD1對于相關(guān)腫瘤形成VM能力的報道。本實驗說明缺氧促進擬態(tài)血管的形成的同時也伴隨著LSD1的表達上升和H3K4(2m)去甲基化酶活性的提高。結(jié)果提示LSD1參與卵巢癌細胞VM的形成。不過，缺氧條件下卵巢癌細胞LSD1對于VM形成的分子機制還需要進一步探討。

4 參考文獻

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