俞麗華 王 鍵 陳業(yè)農(nóng) 胡建鵬

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院組胚生物教研室，安徽 合肥 230038)

腦缺血和缺血后再灌注損傷過(guò)程是極其復(fù)雜的病理生理過(guò)程〔1〕。中醫(yī)藥在其治療和預(yù)防方面取得了一些進(jìn)展，但其病機(jī)復(fù)雜，其治法方藥呈現(xiàn)多樣性，目前療效仍不能令人滿意。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察3種治法的代表中藥復(fù)方對(duì)模型大鼠細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的動(dòng)態(tài)影響，探討其在抗腦缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物分組 健康Wistar雄性大鼠120只，250～300 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)均分為5組(n=24)：假手術(shù)組、模型組、益氣活血組、潛陽(yáng)熄風(fēng)和化痰通腑組，每組再分缺血2 h再灌注24、48、72 h 3個(gè)不同時(shí)點(diǎn)，各時(shí)間點(diǎn)n=8。

1.2藥物與試劑 益氣活血法(選腦絡(luò)欣通)由黃芪、三七、川芎、蜈蚣等藥物配伍組成。潛陽(yáng)熄風(fēng)法：選用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯(懷牛膝30 g、生代赭石30 g、生龍骨15 g、生牡蠣15 g、生龜板15 g、生杭芍15 g、玄參15 g、天冬15 g、川楝子6 g、生麥芽6 g、茵陳6 g、甘草5 g)?；低ǜǎ哼x用星蔞承氣湯(全瓜蔞30 g、膽南星10 g、生大黃10 g、芒硝10 g)。中草藥由安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房提供，中藥制劑室制劑，分別相當(dāng)于原生藥6、14及4.8 g/ml。兔抗鼠ICAM-1一抗、兔抗鼠VEGF一抗、生物素化山羊抗兔二抗、免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3模型制備 采用大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)線栓法改良制作局灶性腦缺血再灌注動(dòng)物模型，并判斷評(píng)分，2～3分入選。

1.4給藥方法與標(biāo)本采集 藥物分別按腦絡(luò)欣通8.61 g·kg-1·d-1、鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯20.3 g·kg-1·d-1及星蔞承氣湯7 g·kg-1·d-1灌胃給藥(相當(dāng)于成人等效劑量7倍)。給藥時(shí)間：術(shù)前半小時(shí)給藥1次，以后每天早晚各1次，最后1次于處死前3 h給藥。分別在缺血2 h再灌注24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間位點(diǎn)處死，造模前1 d晚禁食不禁水。手術(shù)組及模型組按同樣方法予以等量生理鹽水灌胃。在各個(gè)相應(yīng)的時(shí)間位點(diǎn)前，以10%水合氯醛(350 ml/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物，進(jìn)行心臟內(nèi)固定：打開胸腔，于右心耳部剪一小口，從左心室插入導(dǎo)管至主動(dòng)脈，向內(nèi)迅速注入37℃肝素化生理鹽水約200 ml，至右心耳流出液變清亮，然后注入4%多聚甲醛約350 ml，灌流固定30 min后斷頭取腦，除去小腦和腦干，放入4%多聚甲醛中固定1 w，脫水、透明、浸蠟，從視交叉后連續(xù)制作腦部冠狀切片。

1.5免疫組織化學(xué)SABC染色法檢測(cè)大鼠腦組織ICAM-1和VEGF的表達(dá) 切片脫水至蠟，3%過(guò)氧代氫(H2O2)室溫10 min，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；枸櫞酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，以正常山羊血清封閉37℃，20 min；滴加適當(dāng)稀釋的一抗ICAM-1、VEGF(1∶100)，4℃過(guò)夜。生物素化山羊抗兔二抗37℃孵育30 min；SABC復(fù)合工作液37℃，20 min。DAB顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明及封片。陰性對(duì)照采用PBS替代一抗。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠對(duì)腦缺血2 h再灌注不同時(shí)間點(diǎn)大腦ICAM-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 3個(gè)中藥復(fù)方治療組表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞較模型組均顯著減少(P<0.01，P<0.05)，24 h真肝熄風(fēng)湯組最優(yōu)(P<0.05)，48 h星蔞承氣湯組優(yōu)于其他治療組(P<0.01)；72 h各治療組無(wú)明顯差別，可是益氣活血組陽(yáng)性細(xì)胞最少。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠的ICAM-1表達(dá)及VEGF表達(dá)陽(yáng)性面積

2.2各組再灌注不同時(shí)間點(diǎn)VEGF免疫組化結(jié)果 各治療組各時(shí)間點(diǎn)大鼠缺血側(cè)腦組織均見(jiàn)大量VEGF陽(yáng)性顆粒表達(dá)較假手術(shù)組增加(P<0.01)，24 h各組比較鎮(zhèn)肝熄、風(fēng)湯優(yōu)于其他組(P<0.01)，72 h星蔞承氣湯優(yōu)于其他用藥組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3 討 論

研究表明〔2〕局灶性腦缺血和腦缺血后再灌注腦實(shí)質(zhì)微血管內(nèi)皮上ICAM-1表達(dá)增高。在大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注時(shí)12 h內(nèi)明顯升高并達(dá)到高峰，持續(xù)5～7 d，ICAM-1表達(dá)主要位于腦實(shí)質(zhì)血管內(nèi)皮上〔3〕。 鑒于ICAM-1在介導(dǎo)缺血再灌注中白細(xì)胞損傷的作用，近年來(lái)已提出應(yīng)用抗ICAM-1單克隆抗體來(lái)減輕及預(yù)防腦缺血再灌注損傷的設(shè)想，雖然尚未取得共識(shí)，但它的確為腦缺血治療研究開辟了新領(lǐng)域。研究表明〔4〕通過(guò)降低黏附分子含量從而抑制腦缺血再灌注損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng),本研究表明假手術(shù)組有少量表達(dá)，模型組表達(dá)明顯升高，并于24 h達(dá)到高峰，這與文獻(xiàn)〔5〕報(bào)道不完全一致，可能與缺血時(shí)間和程度相關(guān)。

VEGF是高度特異性的內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，它能夠特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及體內(nèi)新生血管形成。VEGF在腦缺血中的保護(hù)機(jī)制有：①促進(jìn)新生血管形成：研究證實(shí)，腦缺血后缺血區(qū)，特別是缺血半暗帶VEGF及其受體VEGFR-1和VEGFR-2通過(guò)低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1調(diào)節(jié)，表達(dá)上調(diào)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生，從而形成新的血管。研究還發(fā)現(xiàn)，缺血〔6〕和缺氧〔7〕大鼠VEGF表達(dá)的時(shí)空分布與血管生成呈正相關(guān)。VEGF在維持或恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性中起重要作用，VEGF可防止毛細(xì)血管消失，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不致發(fā)生程序化死亡。②對(duì)神經(jīng)元的直接保護(hù)作用：研究發(fā)現(xiàn)，將外源性VEGF蛋白應(yīng)用于短暫性腦缺血大鼠腦表面，24 h梗死體積明顯縮小，腦水腫和神經(jīng)元損傷減輕。故Jin等〔8〕指出，在血管形成之前，VEGF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起直接保護(hù)作用，這有助于延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間，直到血管形成發(fā)揮自身搭橋作用，誘導(dǎo)新血管形成，增加受損腦組織再灌注及供氧量，從而減輕腦血管再灌注損傷〔7〕。本結(jié)果提示3種中藥復(fù)方在腦缺血再灌注過(guò)程中通過(guò)上調(diào)VEGF，刺激腦組織建立側(cè)支循環(huán)減輕腦組織損傷。

研究表明〔9〕，中藥復(fù)方有多成分、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)性的特點(diǎn)，它的功效具有明顯的時(shí)效性。本研究表明3種中藥復(fù)方通過(guò)降低ICAM-1和升高VEGF表達(dá)抗腦血管炎癥損傷，保護(hù)血管內(nèi)皮，延長(zhǎng)腦細(xì)胞存活時(shí)間，促進(jìn)新血管形成發(fā)揮自身搭橋作用，增加受損腦組織再灌注及供氧量。至于3種復(fù)方療效的時(shí)間差異可能是復(fù)方的成分和作用途徑的不同，也可能是腦缺血過(guò)程的證侯演變所致，其差異的真正原因還需進(jìn)一步探討。

4 參考文獻(xiàn)

1Stanimirovic D,Satoh K.Inflammatory of cerebral endothelium a role in ischemic brain inflammation〔J〕.Brain Pathol,2000；10(1):113-6.

2Vemuganti R，Dempsey RJ，Bowen KK.Inhibition of intercellular adhesion molecule-1 protein expression by antisense oligonucleotides is neuroprotective after transient middle gerebral artery occlusion in rat〔J〕.Stroke,2004；35:179-84.

3Wang ZQ,Chen XC,Yang GY，etal.Inflammatory reaction after focal cerebral ischemia in mouse〔J〕.Chin Med J(Engl),2004；117:586-91.

4王 軍,張紅霞,賈士奇，等.生姜對(duì)全腦缺血再灌注大鼠腦組織炎性細(xì)胞分子和黏附分子含量的影響〔J〕.醫(yī)學(xué)論壇雜志,2011；32(15):12-8.

5Zhang RI,Chopp M,Zologa C,etal.The temporal profiles of ICAM-mRNA expression after transient MCA occlusion in the rat〔J〕.Brain Res,1995;682:182-8.

6Ogunshola OO,Stewart WB,Mihalcik V,etal.Neuronal VEGF expression correlates with angiogenesis in postnatal developing rat brain〔J〕.Brain Res Dev Brain Res,2000；119:139-53.

7Zhang ZG,Zhang L,Tsang W,etal.Correlation of VEGF and angiopoietin expression with disruption of blood-brain barrier and angiogenesis after focal cerebral ischemia〔J〕.Cereb Blood Flow Metab,2002；22:379-92.

8Jin KI,Mao XO,Greenbrerg DA.Vascular endothelial growth factor:direct neuro-protective effect in vitro ischemia〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A,2000；97(18)：10242-7.

9徐 虹，洪禮傳，黃艷秋，等.針刺對(duì)腦缺血再灌注模型大鼠腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶細(xì)胞間黏附分子表達(dá)的影響〔J〕.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010；30(7)：731-3.