侯向鋒 王成學(xué) 趙 毅 鄭學(xué)清 黃玉龍 張海鵬 鐘子龍 于鐵成

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，吉林 長春 130021)

由機(jī)械刺激引起的組織和細(xì)胞向外釋放ATP，對骨再生的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用〔1〕。最近發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞釋放ATP激活的嘌呤信號通路和自分泌、旁分泌引起的P2嘌呤型的ATP受體激活，對很多生理過程起著重要的調(diào)節(jié)作用〔1〕。細(xì)胞外核苷酸受體稱為P2嘌呤受體，主要包括P2X和P2Y兩大家族。P2X7受體是高表達(dá)的離子型P2X受體，人成骨細(xì)胞以及幾種其他早期的骨來源細(xì)胞表達(dá)功能性的P2X7受體〔1，2〕。P2X7受體的激活會引起成骨細(xì)胞的活化〔1〕并且增加細(xì)胞功能。細(xì)胞外的ATP可通過激活P2X7使p38 MAPK激酶磷酸化〔3〕。筆者推測沖擊波引起的ATP釋放，可能激活hMSCs的P2X7受體。

1 材料與方法

1.1材料 ATP雙磷酸酶、二甲基亞砜、吡哆醛磷酸偶氮苯乙二胺四乙酸二磺酸酯(PPADS)、2′-脫氧N6-甲基腺苷3′,5′-二磷酸鹽(MRS 2179) 和5′-ATP購于 Sigma (St. Louis, MO, USA)；KN-62 (1-〔N, O-(5-isoquinolinesulfonyl) N-methyl-L-tyrosyl〕 4-phenylpiperazine), 蘇拉明和SB203580 購于BioSource International Inc. (Camarillo, CA. USA)； DMEM, 小牛血清 (FBS)和 IMDM培養(yǎng)基(Iscove’s modified Dulbecco’s medium) 購于 GIBCO (Invitrogen Corporation, Tulsa, OK, USA); Oligofectamine來源于Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA)；KDE-2001 體外沖擊波碎石機(jī)來源于北京中科建安科技有限公司(北京, 中國). 精度膜傳感器購于Precision Acoustics Ltd (Dorchester, Dorset DT2 8QH, UK)；聚苯乙烯試管購于Falcon (Becton-Dickson Co., Franklin Lakes, NJ, USA)；超聲傳遞膠購于Pharmaceutical Innovations (Pharmaceutical Innovations Inc., Newark, NJ, USA) ； ATP生物發(fā)光檢定盒購于Calbiochem (San Diego, CA, USA)；溫度控制的輝光值測定儀購于Luminoskan, Labsystems (Helsinki, Finland)；p38 MAPK磷酸化的試劑盒購于Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA).；三羥甲基氨基甲烷/甘氨酸/聚丙烯酰胺梯度電泳凝膠購于Novex (San Diego, CA, USA)；聚偏氟乙烯膜 購于from Millipore Corp. (Bedford, MA, USA)；化學(xué)發(fā)光的試劑購于Cell Signaling Technology。每種試劑溶于蒂羅德溶液并且過濾。

1.2hMSCs的分離培養(yǎng)和鑒定 將5 ml肝素化人骨髓血標(biāo)本移入15 ml無菌離心管中，加入5 ml的L-DMEM溶液吹打、混合，分散細(xì)胞。室溫下1 000 r/min×5 min離心，棄上清液。加入5 ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)吹打、重懸細(xì)胞。將上述懸液輕輕加至5 ml的1.073 g/ml的Percoll分離液上，室溫下2 000 r/min×20 min離心。吸取離心管中血清層下的低密度MNC層，轉(zhuǎn)移至另1個(gè)離心管中。加入5 ml PBS溶液混合，室溫下1 200 r/min×10 min離心，棄上清液，洗滌2次。培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后半量換液，以后每3～4 d全量換液。待細(xì)胞長滿皿底85%后1∶3傳代。取P4的細(xì)胞用于本研究。

流式細(xì)胞儀用BD FACSort(Becton Dickinson)用Cell Quest 軟件(Becton Dickinson) 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，未誘導(dǎo)的hMSCs表型CD73和CD105陽性，CD34和CD45造血譜系和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記則呈陰性。

1.3體外沖擊波處理hMSCs 采用MODEL KDE-2001體外液波碎石機(jī)，在工作電壓7 KV，電容0.3 μF時(shí)，頻率50 Hz，最大正向壓力波(30±1.9)mPa，通過水下兩電極放電，于半橢圓形的第一焦點(diǎn)產(chǎn)生的沖擊波，經(jīng)過光滑的半橢圓形的剛體表面匯聚到第二焦點(diǎn)，形成能量密度為0.18 mJ/mm2的低能沖擊波。將目標(biāo)細(xì)胞0.5 ml裝入聚丙烯小塑料瓶中，先將其固定，然后通過C型臂X射線透視裝置將小塑料瓶定位在半橢圓形的第二焦點(diǎn)處。盡量使小瓶的液體無氣泡，同時(shí)盡量使第一焦點(diǎn)產(chǎn)生的沖擊波，通過一個(gè)液體的無氣泡的媒介傳到第二焦點(diǎn)處的細(xì)胞，這樣能最大限度地減少?zèng)_擊波的能量損失。先將細(xì)胞(1×106/ml) 懸浮于2 ml 試管含有0.5 ml IMDM培養(yǎng)基(pH7.4)，然后用沖擊波作用0、50、100、150 次(能量密度0.18 mJ/mm2)。沖擊波作用時(shí)間10～20 min，具體時(shí)間依賴作用次數(shù)。

1.4細(xì)胞活性評估 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器通過0.4%臺盼藍(lán)染色分析細(xì)胞數(shù)量和活性。用 1 ml 的IMDM培養(yǎng)基，將被檢測的細(xì)胞(106/ml) 懸浮于12孔的培養(yǎng)板。5 min后檢測細(xì)胞活性。將20 μl的懸浮細(xì)胞和20 μl 的 0.4%臺盼藍(lán)(GIBCO, Invitrogen Corporation, Tulsa, OK) 溶液混合后，在常溫下孵育3 min。然后將一滴上述細(xì)胞混合液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Haimen Tianlong Scientific Instruments, Jiangsu, China)監(jiān)測。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀被放置在雙目顯微鏡下，未染色的細(xì)胞是有活性的細(xì)胞，染色的是沒有活性的細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)細(xì)胞然后求出百分比。

1.5細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白樣品的準(zhǔn)備 將沖擊波(0.18 mJ/mm2，100 次)或 ATP (1 μmol/L ATP ， 5 min)作用過的hMSCs (106細(xì)胞/ml) ，用冷卻的緩沖溶液Dulbecco’s phosphate-buffered saline (KD Medical, Inc., Columbia, MD)沖洗，然后用200 μl 的20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 懸浮于離心管中，其中含有蛋白酶抑制劑(Sigma)。 細(xì)胞懸液以1次/s脈沖的頻率超聲處理3次，然后轉(zhuǎn)入離心管中，用Beckman超速離心機(jī)以200 000 r/min離心1 h，分離細(xì)胞質(zhì)(上清)和細(xì)胞膜(沉淀)的碎片。 將離心后的沉淀，用200 μl含有蛋白抑制劑 (Calbiochem) 和1% Triton X-100的20 mmol/L Tris-HCl (pH7.4) ，懸浮于離心管中。然后冰裕1 h， 加入100 μl 含有1% Triton X-100的溶解緩沖液。將上述混合液以1次/s脈沖的頻率超聲處理3次，然后將處理過的細(xì)胞超聲離心(200 000 r/min，1 h)，這時(shí)得到的上清液為含有Triton X-100-溶解的膜蛋白樣品。

1.6免疫印跡檢測 用PhosphoPlus?p38 MAP 抗體試劑盒(Cell Signaling Technology, Inc., USA)，檢測hMSCs 的p38 MAPK激酶的磷酸化。 簡而言之，將沖擊波(0.18 mJ/mm2，作用 0、50、100、150、200、250 次的hMSCs (106細(xì)胞/ml) ，培養(yǎng)于12孔板中(含有10%FBS的IMDM 培養(yǎng)基)45 min。然后放在冰上，離心， 懸浮于100 μl 含有100 mmol/L二硫蘇糖醇的冰冷的十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液中，煮沸裂解5 min。將裂解物用三甘氨酸聚丙烯酰胺梯度凝膠(Novex, San Diego, CA)電泳分離。然后將膜用分別用抗磷酸化的p38 MAPK(on Thr180/Tyr182) 的抗體和抗p38 MAPK的抗體封閉。將PDVF膜上的磷酸化的 p38 MAPK 或 總p38 MAPK，用LumiGLO?發(fā)光試劑(Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) 通過X膠片檢測。用圖型軟件(Image Tool 3.00) 比較分析各樣品間的差異。將細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白的樣品用三甘氨酸聚丙烯酰胺梯度凝膠(Novex, San Diego, CA)電泳分離，然后再將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜(Immobilon-P; Millipore Corp., Bedford, MA)上。將膜和鼠抗β-actin抗體(Biomiga Inc, San Diego, CA, USA)和兔抗P2X7受體抗體(Alomone Labs, Jerusalem, Israel)共浴。將膜洗過后，與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊第二抗體共浴。用LumiGLO?發(fā)光試劑(Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA) 通過X膠片檢測。用圖型軟件(Image Tool 3.00) 比較分析各樣品間的差異，通過與β-actin抗體比較，分析樣品P2X7受體表達(dá)程度。

1.7檢測ATP的釋放量 用檢測ATP濃度的生物發(fā)光檢測試劑盒(San Diego, CA, USA)測定細(xì)胞外的ATP劑量。將被檢測的細(xì)胞調(diào)成5×106/ml，懸浮于無血清的IMDM培養(yǎng)基中，于37℃孵箱靜止3 h。在有100 μmol/L suramin存在的情況下(suramin能有效抑制細(xì)胞外的ATP降解)，用沖擊波處理細(xì)胞。然后立即將細(xì)胞放在冰上，12 000 r/min 離心5 min，分別將上述細(xì)胞以每孔50 μl 轉(zhuǎn)移到96孔板中，再將溶解在IMDM中的熒光素酶試劑以每孔50 μl加入96孔板。然后將96孔板放入溫度控制的發(fā)光計(jì)中讀取數(shù)據(jù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算ATP濃度。重復(fù)試驗(yàn)3次。

1.8沉默P2X7 受體 將特異的siRNA轉(zhuǎn)染給hMSCs，消除細(xì)胞內(nèi)的P2X7受體的表達(dá)。P2X7 受體特異的siRNA( P2X7 receptor-specific siRNA， P2X7R-siRNA)和沒有作用靶點(diǎn)的非特異siRNA購于Dharmacon (Lafayette, CO, USA). 用轉(zhuǎn)染試劑Oligofectamine (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)將這些siRNA(最后的終濃度為140 nmol/L)轉(zhuǎn)染給細(xì)胞。將細(xì)胞離心后，用無血清培養(yǎng)基洗滌一次，然后將這些細(xì)胞和siRNA 在無血清的條件下培養(yǎng)24、48、72 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.9檢測P2X7 受體mRNA表達(dá) 采用即時(shí)RT-FPCR定量分析基因表達(dá)水平，以 β-actin作為內(nèi)參。P2X7 mRNA引物：P2X7: 5′-ATC GGC TCA ACC CTC TCC TAC-3′, 5′-CTG GAG TAA GTG TCG ATG AGG AAG-3′。

1.10免疫細(xì)胞化學(xué)分析細(xì)胞表面的P2X7 受體表達(dá) 先在冰上將細(xì)胞用4%低聚甲醛(溶于PBS)固定10 min，再加入兔抗P2X7受體抗體(1∶100; Alomone Labs, Jerusalem, Israel)4℃ 過夜染色。沖洗細(xì)胞后，加入山羊抗兔Alexa 555抗體(1∶2 000, Molecular Probes)室溫下孵育1 h，再?zèng)_洗，加上封固劑(Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)和蓋玻片。對照組細(xì)胞在沒有一抗的條件下染色。用裝配Hamamatsu ORCA II 相機(jī)(Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan)的Leica DMIRB熒光顯微鏡(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)，給熒光染色和明亮視野下的細(xì)胞照相。

2 結(jié) 果

2.1沖擊波作用引起hMSCs 向外釋放ATP 當(dāng)沖擊波的作用次數(shù)<200時(shí)，沖擊波對細(xì)胞的活性影響不超過>95%。然而當(dāng)沖擊波的作用次數(shù)≥200 時(shí)，細(xì)胞活性受到顯著影響，這些和沖擊波引起的ATP向細(xì)胞外釋放相平行，ATP的釋放量和沖擊波的作用次數(shù)成正相關(guān)。

2.2沖擊波激活hMSCs的p38 MAPK傳導(dǎo)通路 100 次的沖擊波作用可引起p38 MAPK的磷酸化(圖1A)。在hMSCs 的細(xì)胞外培養(yǎng)基中加入0.1～1 μmol/L的ATP，當(dāng)ATP濃度>1 μmol/L 時(shí)可導(dǎo)致細(xì)胞p38 MAPK 磷酸化程度降低(圖1B)。

2.3P2X7受體介導(dǎo)了沖擊波和ATP引起的p38 MAPK通路激活 Apyrase, PPADS, P2X7R-siRNA以及 KN-62可有效減弱沖擊波引起的p38 MAPK 激酶的磷酸化 (圖1C)。 這些試劑同樣有效抑制了細(xì)胞外ATP(1 μmol/L)引起的p38 MAPK的活化(圖1D)。

2.4P2X7受體在hMSCs的表達(dá)和功能 hMSCs 表達(dá)P2X7 受體，沖擊波和細(xì)胞外ATP作用1 h后，能夠引起P2X7受體的高表達(dá) (圖2)。

圖1 沖擊波通過P2X7受體激活p38MAPK通路

圖2 沖擊波引起P2X7受體表達(dá)增加

3 討 論

盡管沖擊波療法已經(jīng)在骨科得到了廣泛應(yīng)用，但是現(xiàn)在還不清楚沖擊波促進(jìn)骨折愈合的確切機(jī)制。組織學(xué)研究顯示沖擊波能夠刺激骨再生，但是缺乏支持這一觀點(diǎn)的臨床和試驗(yàn)基礎(chǔ)研究。本研究結(jié)果第一次證明hMSCs表達(dá)功能性的受體，沖擊波通過促使細(xì)胞分泌ATP，引起hMSCs的p38 MAPK激酶磷酸化。顯然體外培養(yǎng)的hMSCs能夠自發(fā)分泌ATP，濃度在3～7.5 nmol/L。這一ATP濃度太低不能激活P2X7受體。沖擊波能夠引起高濃度的ATP向外釋放(6.9 μmol/L)，這一濃度能夠有效激活P2X7受體和p38 MAPK信號通路，這是誘導(dǎo)hMSCs向成骨分化的重要步驟。在體內(nèi)，沖擊波的作用可能通過引起細(xì)胞內(nèi)的ATP向外釋放導(dǎo)致作用點(diǎn)的ATP濃度增加，消除細(xì)胞外的ATP和抑制P2X7受體能夠抑制沖擊波引起的p38 MAPK的活化、c-Fos、c-Jun的轉(zhuǎn)錄。SB203580為p38 MAPK的抑制劑，能夠有效抑制沖擊波引起的hMSCs的成骨分化。這些發(fā)現(xiàn)暗示ATP釋放、激活P2X7受體以及p38 MAPK的激活是引起c-Fos、c-Jun表達(dá)增加和成骨分化的上游信號通路。

P2X7受體充分表達(dá)在骨細(xì)胞的表面，其是受ATP控制的非選擇的離子通路(調(diào)控Na+, K+, 和Ca2+通透)。P2X7受體對骨形成和吸收的調(diào)節(jié)起著非常重要的作用，骨細(xì)胞的前列腺素的分泌和繼發(fā)的骨形成離不開ATP引起的P2X7受體的激活。這些過程可能是沖擊波療法引起的信號通路的下游結(jié)果。當(dāng)受到紫外線、活性氧以及細(xì)胞內(nèi)或環(huán)境的應(yīng)力作用，MAPK激酶成員之一p38 MAPK將要被優(yōu)先激活。G蛋白耦聯(lián)的受體對于p38 MAPK的激活起著一定的作用，暗示P2X7受體對于沖擊波和細(xì)胞外的ATP引起的hMSCs 的p38 MAPK激酶的活化負(fù)責(zé)。

總之，本研究證明ATP釋放和P2X7受體信號傳導(dǎo)路促進(jìn)hMSCs的p38 MAPK激酶磷酸化。這些研究支持前人的報(bào)道，細(xì)胞外的ATP通過激活P2X7受體，引起成骨細(xì)胞的增殖和鈣化作用〔4～7〕。沖擊波引起hMSCs釋放的ATP，激活P2X7受體信號傳到通路可能引起hMSCsp38 MAPK激酶磷酸化，這些可能增加骨不連的病人的骨愈合。本文數(shù)據(jù)暗示這可能是沖擊波促進(jìn)骨愈合的機(jī)制，但這不是唯一的機(jī)制。除了hMSCs以外，沖擊波可能引起許多其他類型的細(xì)胞向外釋放ATP。對于沖擊波作用的病人而言，沖擊波引起作用部位的細(xì)胞，而不是hMSCs向外釋放ATP，這些細(xì)胞外的ATP通過直接或間接作用hMSCs，促成了骨愈合?，F(xiàn)在的體外細(xì)胞學(xué)研究不能夠闡明除了hMSCs外何種細(xì)胞參與到?jīng)_擊波的促進(jìn)成骨的機(jī)制中。這樣，需要另外的體內(nèi)研究進(jìn)一步證明沖擊波作用和ATP信號傳導(dǎo)路如何引起hMSCs向骨折部位的聚集、hMSCs向成骨細(xì)胞分化和其他促進(jìn)骨形成的信號傳導(dǎo)路。

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