李克研 李今朝 屈寶澤 李 寧

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心臟內(nèi)科,遼寧 錦州 121000)

研究表明炎癥介質(zhì)如白細(xì)胞介素(IL)-1、腫瘤壞死因子(TNF) 在動脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用，慢性心力衰竭(CHF)與炎癥的關(guān)系日益受到人們的重視〔1〕。IL-1是一種重要的炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，與慢性炎癥的活躍性有著密切的關(guān)系〔2〕。IL-1基因簇定位于2q13，包括IL-1α、IL-1β、IL-1受體拮抗物，IL-1的基因多態(tài)性與許多炎癥反應(yīng)性疾病有著緊密的聯(lián)系〔3，4〕。IL-1β+3953位點(diǎn)位于IL-1β基因第五外顯子區(qū)，存在1個C到T的替換，本研究觀察IL-1β +3953基因多態(tài)性與CHF發(fā)病的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1研究對象 錦州市中心醫(yī)院和遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院80例CHF患者，其中男45例，女35例，年齡55～65歲，符合以下條件：①CHF診斷參照Framingham 標(biāo)準(zhǔn)，心功能NYHA 分級Ⅱ～Ⅳ級、超聲心動圖左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<45%； ②CHF病史至少≥3個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝、腎功能不全；②嚴(yán)重的急性感染或代謝紊亂；③急性心力衰竭。健康對照組經(jīng)體檢排除心血管疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、甲狀腺疾病及糖尿病。男42例，女38例。均知情同意。

1.2樣本采集和DNA提取 取受試者前臂靜脈血5 ml，注入裝有EDTA 抗凝劑的試管中備用，應(yīng)用小劑量基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，具體步驟參照說明書。

1.3IL-1β+3953/Taq Ⅰ基因型測定 采用PCR 擴(kuò)增IL-1β+3953片段，然后用限制性內(nèi)切酶Ava Ⅰ酶切法鑒定其基因型。引物序列為A：5′-TTCAGTTCATATGGACCAGA-3′,B：5′-GTTGTCATCAGACTTTGACC-3′ (大連寶生物公司)。20 μl反應(yīng)體系包括10×緩沖液2 μl，dNTP 1 μl (2 mmol/L)，MgCl2(25 mmol/L) 1 μl，上、下游引物各1 μl (4 μmol/L)，基因組DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，無菌去離子水補(bǔ)充至20 μl。循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性94℃,5 min，94℃，30 s，52℃，50 s，72℃，1 min，共35個循環(huán)，最后延伸72℃，10 min，4℃ 保存，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小為249 bp。

1.4限制性內(nèi)切酶酶切多態(tài)性分析 根據(jù)文獻(xiàn)〔3〕，用限制性內(nèi)切酶Taq Ⅰ (大連寶生物公司提供)消化PCR產(chǎn)物：取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，Taq Ⅰ內(nèi)切酶2 U，10×酶切緩沖液1 μl，無菌去離子水補(bǔ)足至總體積10 μl，37℃水浴酶切過夜，酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)直接讀取基因型結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件，經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1基因組DNA提取結(jié)果及PCR擴(kuò)增結(jié)果 基因組DNA經(jīng)試劑盒提取效果較好?；蚪MDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)中觀察，目的片段大小為304 bp,見圖1。

2.2IL-1β+3953/TaqⅠ基因型判定結(jié)果 1號和3號樣本3條帶，分別為114、135和249 bp，基因型為CT；2號樣本兩條帶，分別為114和135 bp，基因型為CC。見圖1。

M:Marker,分子量標(biāo)準(zhǔn)品；1，2,4,5,6：CC基因型； 3:CT基因型

2.3IL-1β+3953/Taq Ⅰ等位基因及基因型頻率分布 兩組均以CC基因型和C等位基因?yàn)橹?。見?。

表1 IL-1β+3953/TaqⅠ的基因型頻率及等位基因頻率〔n(%)，n=80〕

2.4兩組基因型及等位基因頻率比較 兩組IL-1β+3953位點(diǎn)基因型分布無差異(χ2=0.592,P>0.05，OR=1.490，95%CI0.537～4.132)，等位基因分布亦無差異(χ2=0.504,P>0.05，OR=1.403，95%CI= 0.549～3.585)。見表1。

3 討 論

IL-1β是IL-1家族的一種激動劑,由各種有核細(xì)胞分泌,主要參與局部炎癥和細(xì)胞內(nèi)事件的調(diào)節(jié)。IL-1β通過識別靶細(xì)胞上的受體而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)〔5〕。研究表明局部和全身炎癥在動脈粥樣硬化及其CHF發(fā)生和發(fā)展中起重要的作用。炎癥介質(zhì)如IL-1和TNF-α均可促進(jìn)低密度脂蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的結(jié)合，啟動細(xì)胞內(nèi)一系列的反應(yīng)過程和炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生〔6〕。本研究與朱銀華等〔7〕對CHF患者IL-1β+3953 位點(diǎn)的研究結(jié)果相一致。CHF的病因很復(fù)雜，臨床表現(xiàn)也多種多樣，雖然IL-1+3953 基因多態(tài)性與CHF發(fā)病的相關(guān)性有待進(jìn)一步證實(shí)，但是通過大量的研究已發(fā)現(xiàn)IL-1的基因多態(tài)性在冠心病的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用〔8〕。

4 參考文獻(xiàn)

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7朱銀華，徐永春，周 斌，等.白細(xì)胞介素-1β基因啟動子-31T/C和外顯子5+3953C/T多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究〔J〕.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009；40(1)：73-6.

8李漢成，吳開毅，趙 錦.IL-1-511基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)性研究〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2012；4(18)：1085-7.