楊非柯 劉竟芳 陳 偉 何新平

(長沙市中心醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，湖南 長沙 410004)

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)重要的病理生理學(xué)基礎(chǔ)〔1〕。研究發(fā)現(xiàn)大量糖的攝入會導(dǎo)致骨骼肌和脂肪組織產(chǎn)生IR，這表明高糖在IR的誘發(fā)中發(fā)揮著十分重要作用〔2,3〕。然而有研究發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)IR中存在性別差異，即高糖飲食喂養(yǎng)成年雄性SD大鼠可形成IR，而雌性SD大鼠卻不能形成IR，但是高糖喂養(yǎng)去卵巢雌性大鼠可形成IR〔4〕。這些結(jié)果說明雌性大鼠體內(nèi)的性激素可能是高糖難以誘導(dǎo)雌性大鼠形成IR的原因。胰島素與其受體結(jié)合后，通過磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)/蛋白激酶B(PKB/Akt)和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路，促進胰島素主要的效應(yīng)蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運體4(GLUT4)的表達和轉(zhuǎn)位〔5,6〕。然而17-β-雌二醇(E2)是否通過影響GLUT4表達而拮抗高糖誘導(dǎo)的IR，目前還未見文獻報道。因此本研究采用高果糖飲食喂養(yǎng)去卵巢大鼠誘導(dǎo)IR形成，觀察17-β-雌二醇對GLUT4表達和磷酸化Akt水平的影響。

1 材料和方法

1.1主要儀器及試劑 17-β-雌二醇為Sigma 公司產(chǎn)品。鼠尾動脈血壓儀(HX-Ⅱ型)由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室提供。全自動γ計數(shù)儀由上海第二儀器廠生產(chǎn)。全自動生化分析儀為日本日立公司產(chǎn)品。垂直電泳儀與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)為美國BioRad公司產(chǎn)品。ABI7500熒光定量PCR儀及分析軟件購自美國ABI 公司。GOS7500型凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國UVP公司。Moloney小鼠白血病病毒(MMLV)第一鏈cDNA合成試劑盒、Hot Star Taq Master Mix試劑和總RNA提取試劑盒購自美國Iinvitrogen公司。兔抗大鼠GLUT4和p-Akt單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗Santa Cruz公司產(chǎn)品。BCA蛋白定量試劑購自美國Pierce公司。雌二醇和胰島素放免法檢測試劑盒由北京東雅生物工程公司提供。引物和D-果糖由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2去卵巢胰島素抵抗動物模型制備和實驗分組 清潔級成年雌性SD大鼠40只，約3月齡，體重(200±20)g，由中南大學(xué)實驗動物學(xué)部提供。大鼠購進后適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，然后隨機均分為四組，每組10只：正常對照組大鼠普通飼料喂養(yǎng)8 w；模型組大鼠卵巢切除后高果糖飼料喂養(yǎng)8 w；17-β-E2替代組大鼠卵巢切除后高果糖飼料喂養(yǎng)8 w，同時將17-β-E2(30 μg/kg體重)〔7,8〕進行皮下注射，1次/d。溶媒對照組10只，卵巢切除后高果糖飼料喂養(yǎng)8 w，同時每天皮下注射無水乙醇(30 μl/kg)。高果糖飼料中三大能量物質(zhì)按熱卡計算：果糖占60%，脂肪占11%，蛋白質(zhì)占29%。大鼠由專人飼養(yǎng)，自由進食水，12 h光照，溫度在(22±3)℃，每籠8只。

1.3卵巢切除術(shù) 大鼠于術(shù)前禁食12 h，自由飲水。1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定大鼠。無菌狀態(tài)下，做腹正中切口打開腹腔，找到雙角子宮，分別沿每側(cè)子宮找到卵巢，仔細分離周圍組織，充分暴露卵巢。在卵巢與子宮相連接處結(jié)扎后，切除卵巢，分層縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)后未用抗生素，大鼠自然清醒。

1.4大鼠體重、血壓、血脂、血清雌激素水平的測定和胰島素敏感指數(shù)的計算 果糖喂養(yǎng)后第8周末，大鼠于實驗前禁食和禁水12 h，在清醒狀態(tài)下用套尾法測量尾動脈的收縮壓(SBP)。用電子稱稱量大鼠體重(BW)。1%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定，采用心臟放血制備血清。分離兩側(cè)腎周及附睪周圍脂肪組織作為內(nèi)臟脂肪(VF)，稱重并計算其與體重的比值(VFW/BW)。全自動生化分析儀測定空腹血糖(FBS)和血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C )和密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。放射免疫法測定血清雌激素濃度和空腹胰島素(FSI)水平。按照李光偉等〔9〕的方法計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。

1.5骨骼肌葡萄糖攝取率的測定 取大鼠股四頭肌組織約200 mg，將骨骼肌撕成肌絲置于含Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液(KRBB)的試管中，37℃振搖孵育30 min。將肌肉轉(zhuǎn)移到新鮮的KRBB液中孵育2 h后，將3H-2-脫氧葡萄糖(3H-2-DG) 加入各實驗管孵育30 min。各管加入3.0 ml冷的KRBB以終止反應(yīng)。肌肉勻漿去蛋白后4 000 r/min離心15 min，取上清液進行液閃計數(shù)。葡萄糖攝取率(GUR)表示為3H計數(shù)值與組織重量的乘積〔10〕。

1.6實時定量PCR測定骨骼肌中GLUT4 mRNA表達水平 取適量的大鼠股四頭肌，按照Trizol試劑盒說明提取細胞的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，以提取的總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)擴增，合成cDNA第一鏈。取適量的cDNA樣品進行10倍梯度稀釋，分別進行實時定量PCR反應(yīng)擴增，反應(yīng)總體系為25 μl，包括cDNA 4 μl，PCR上下游引物及探針(10 μmol/L)各0.3 μl,Hot Star Taq Master Mix (2×)12.5 μl,滅菌去離子水補足總體積到25 μl。PCR擴增程序為：95℃ 10 min以激活Hot Star Taq DNA合成酶，擴增循環(huán)94℃ 60 s,60℃ 90 s，共55個循環(huán)。反應(yīng)體系加入96孔板中，每個樣品設(shè)置3個平行重復(fù)孔。GLUT4引物為:上游：5′- GGCTGTGAGTGAGTGCTIT-3′，下游: 5′- GGTITCTGCTCCCTATCGT-3′。同時擴增β-actin作為內(nèi)參，β-actin引物為：上游：5′-CCATCATCTTGCAGGAGCG-3′，下游：5′-CTGGCAGTGAGCTATACTCG-3′。結(jié)果分析以對照組為100%對GLUT4 mRNA的表達進行分析。

1.7Western印跡分析測定骨骼肌中GLUT4蛋白的表達水平 取適量股四頭肌組織用4℃預(yù)冷的PBS清洗3次，棄PBS液。加入200 μl蛋白裂解緩沖溶液，輕輕吸打數(shù)次，冰上裂解細胞20 min。待細胞完全裂解后，用細胞刮將細胞全部刮下并轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中。4℃離心30 min。然后收集上清液至無菌的1.5 ml離心管中，上清液為細胞總蛋白，立即吸取10 μl上清液進行蛋白濃度測定。取50 μg蛋白質(zhì)樣本加入2×SDS凝膠加樣緩沖液中，煮沸使蛋白質(zhì)變性。然后用6%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離,電壓為80 mA，電泳2 h，將分離的蛋白質(zhì)用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,采用麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果,并確定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準位置。然后用5%脫脂牛奶室溫封閉2小時，加入1∶150兔抗鼠ABCA1和p-Akt一抗，4℃過夜。三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)液洗膜3次，5 min/次。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，4℃孵育4 h，TBST液洗膜3次。蛋白質(zhì)印跡熒光檢測試劑盒顯示于X光片。以同樣的方法顯示β-actin，以此作為加樣的內(nèi)參。經(jīng)顯影和定影后，凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片進行掃描和半定量分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠體重、SBP、血清FBS、FSI、ISI、E2的變化 如表1所示：去卵巢IR模型組大鼠的體重、SBP、FBS和 FSI水平與正常對照組相比均顯著升高(均P<0.05)，而ISI和血清E2水平與正常對照組相比均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。與去卵巢IR模型組相比，17-β- E2替代組大鼠的體重、SBP、FBS和 FSI 水平均顯著降低(均P<0.05)，ISI和血清E2水平均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。溶媒對照組與模型組相比較以上各項指標均無顯著差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠體重、SBP、FBS、FSI、ISI、E2的水平

2.2大鼠內(nèi)臟VFW、血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平和骨骼肌葡萄糖攝取率的變化 見表2,模型組大鼠的VFW、VFW/BW值、TG、TC和LDL-C水平與正常對照組相比均顯著性升高(均P<0.05)，HDL-C水平和股四頭肌糖攝取均顯著性減低(均P<0.05)。17-β-E2替代組大鼠的VFW、VFW/BW值、TG、TC和LDL-C水平均顯著性降低(均P<0.05)，HDL-C水平和股四頭肌糖攝取均顯著性增加(均P<0.05)。溶媒對照與模型組相比各項指標均無顯著性差異(P>0.05)。

表2 各組大鼠內(nèi)臟VFW、血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的水平和股四頭肌葡萄糖攝取率

2.317-β-E2對股四頭肌中GLUT4 mRNA和蛋白表達的影響 采用實時定量PCR和Western 印跡分別分析測定股四頭肌中GLUT4 mRNA和蛋白的表達。如圖1所示：去卵巢IR模型組大鼠股四頭肌中GLUT4 mRNA和蛋白的表達與正常對照組相比均顯著性降低(GLUT4 mRNA分別35.73±5.27和100.00±0.00;GLUT4蛋白分別34.19±5.27和86.13±9.67)(均P<0.05)，而與模型組相比17-β-E2顯著上調(diào)大鼠股四頭肌中GLUT4 mRNA和蛋白的表達(94.67±11.42,85.49±10.08，均P<0.05)。溶媒對照組與17-β-E2替代組相比大鼠股四頭肌中GLUT4 mRNA和蛋白的表達沒有差異顯著性(36.81±4.86,35.69±4.72,P>0.05)。

2.417-β- E2對磷酸化Akt蛋白水平的影響 采用Western印跡分析測定股四頭肌中磷酸化Akt蛋白的水平。如圖2所示：與正常對照組相比，去卵巢IR模型組大鼠股四頭肌中磷酸化Akt的水平顯著性降低(68.43±9.64,28.39±4.12,P<0.05)，而與模型組相比，17-β-E2顯著性上調(diào)大鼠股四頭肌中磷酸化Akt的水平(69.14±8.31,P<0.05)。溶媒對照組與17-β-E2替代組相比大鼠股四頭肌中磷酸化Akt的水平?jīng)]有差異顯著性(27.34±3.57,P>0.05)。

圖1 17-β- E2對股四頭肌GLUT4蛋白表達的影響

圖2 17-β- E2對磷酸化Akt蛋白水平的影響

3 討 論

IR時胰島素的靶組織如：骨骼肌和脂肪組織等對內(nèi)源性胰島素的生物效應(yīng)降低，導(dǎo)致葡萄糖攝取和利用發(fā)生障礙。胰島素是體內(nèi)促進合成代謝的主要激素，也是體內(nèi)唯一具有降血糖作用的激素，由胰島的β細胞分泌后經(jīng)血液循環(huán)運到達相應(yīng)的靶組織和器官。胰島素與其受體結(jié)合，通過一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而產(chǎn)生效應(yīng)。胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)通路和絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路。前一通路主要介導(dǎo)胰島素調(diào)節(jié)代謝的作用，后一通路主要介導(dǎo)胰島素促生長的作用。PI-3K信號通路在胰島素抵抗的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，而蛋白激酶B(PKB/Akt)是PI-3K重要的下游信號分子，通過 Akt 的磷酸化調(diào)節(jié)GLUT4的表達和轉(zhuǎn)位，因此其磷酸化水平的高低可反映胰島素信號通路的激活狀態(tài)〔11,12〕。

目前認為胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損是IR發(fā)生的主要原因，他分為三個環(huán)節(jié)：胰島素受體前、受體、受體后水平的障礙，其中受體后水平的障礙包括葡萄糖激酶活性的降低、葡糖糖轉(zhuǎn)運和糖原合成障礙等倍受人們的關(guān)注成為研究的熱點〔13,14〕。骨骼肌是胰島素重要的外周靶器官，骨骼肌糖原合成對機體血糖的穩(wěn)定發(fā)揮著重要的作用。GLUT4是骨骼肌糖代謝的主要限速環(huán)節(jié)。研究顯示在IR狀態(tài)或糖尿病大鼠中骨骼肌GLUT4的表達和葡萄糖的攝取顯著性降低〔15，16〕。

研究表明雌激素可改善IR狀態(tài)、提高靶組織對胰島素的敏感性、糾正IR狀態(tài)下的血脂紊亂、降低冠心病的發(fā)病危險〔17,18〕。Xie等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)雌激素預(yù)處理可抑制高濃度的胰島素引起的HepG細胞中胰島素受體和胰島素受體底物1-2(IRS1-2)的表達降低及IR的產(chǎn)生。Gonzalez等〔20〕也發(fā)現(xiàn)雌激素能夠增加雌性S-D大鼠骨骼中的胰島素受體的表達，增加胰島素的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體β的激活可以調(diào)節(jié)GLUT4的表達二雌激素受體α的刺激可以增加骨骼肌葡萄糖的攝取〔21,22〕。

本研究結(jié)果表明高果糖可能通過損傷胰島素的信號傳導(dǎo)通路而導(dǎo)致IR。17-β-E2可能是通過增加骨骼肌中p-Akt 磷酸化的水平和GLUT4的表達，增強胰島素的信號傳導(dǎo)，防止高果糖飲食誘導(dǎo)的去卵巢大鼠IR的產(chǎn)生。然而Barros等〔23〕研究發(fā)現(xiàn)大鼠懷孕期間的雌激素水平的升高可以減少骨骼肌GLUT4的表達，降低了胰島素的敏感性，導(dǎo)致妊娠IR和妊娠糖尿病。這些矛盾的結(jié)果可能與妊娠期間其他的激素如：孕激素等的改變有關(guān)。

17-β-E2抑制高果糖誘導(dǎo)的去卵巢大鼠胰島素抵抗，其機制可能與17-β-E2上調(diào)骨骼肌中p-Akt和GLUT4的表達有關(guān)。

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