王 雅 趙 星 馬從乾 楊 軻

(南陽市中心醫(yī)院血管外科，河南 南陽 473000)

細胞周期調(diào)控異常是細胞發(fā)生凋亡的一個關(guān)鍵性事件，其核心成分為細胞周期蛋白及細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK1)。Cdc25c是CDK1的一個新家族，在G2/M期轉(zhuǎn)變中有重要的作用〔1〕。Cdc25c通過活化Cyclin B/Cdc 2復(fù)合物使細胞由G2期進入M期來對細胞起調(diào)控作用；Cdc25c作為ATM/ATR-Chk2/Chk1-Cdc25信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導途徑的下游底物，是G2/M期檢查點重要效應(yīng)因子〔2～4〕。本實驗通過大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，探討Cdc25c對缺血再灌注肝臟細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 清潔級雄性SD大鼠30只，體重300～350 g, 購于河南省實驗動物中心。按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組(S組)；缺血再灌注+生理鹽水組(I/R組)；pAdEasy-Cdc25c +缺血再灌注組(C組)，每組10只。

1.2模型建立 腹腔注射1%戊巴比妥鈉 (0.4～0.6 ml/100 g),劍突下行正中腹部切口3～4 cm，打開腹腔，暴露肝門，用無損傷血管鉗夾閉門靜脈，肝動脈造成全肝缺血30 min后，松夾恢復(fù)血流再灌注2 h。I/R組和C組在模型建立前12 h分別經(jīng)門靜脈注射生理鹽水和pAdEasy-Cdc25c。手術(shù)完畢后，取肝組織放置于液氮和甲醛中。

1.3Western印跡 取100 mg組織及1 ml的RIPA和10 μl的甲苯基磺酰氟(PMSF)放入EP管并置于超聲組織破碎儀中，之后按照RIPA裂解液說明書提取組織蛋白。二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度。取30 μg的組織總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳100 V，待蛋白至分離膠后120 V。濕轉(zhuǎn)220 mA，2 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%的脫脂奶粉封閉1 h。加入1∶1 000的1×鹽酸緩沖液(TBS)稀釋的一抗 Cdc25c(Santa Cruz公司兔抗多克隆抗體)及1∶1 000的1×TBS稀釋的一抗Caspase 3(Santa Cruz公司兔抗單克隆抗體)，4℃過夜。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶3 000的1×TBS稀釋的二抗(北京康為世紀的山羊抗兔IgG-HRP)，室溫1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶1 000的1×TBS稀釋的一抗(北京康為世紀的兔抗鼠內(nèi)參GAPDH一抗)，4℃過夜。1×TBST洗膜3次，10 min/次。加入1∶3 000的1×TBS稀釋的二抗(北京康為世紀公司的山羊抗兔lgG-HRP)，室溫1 h。1×TBST洗膜3次，10 min/次。待暗室加入增強化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑曝光，顯影。使用Quantity-one軟件計算各個樣本Cdc25c蛋白表達水平。

1.4免疫組織化學法 標本經(jīng)甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋，連續(xù)4 μm切片，分別作蘇木素-伊紅(HE)和免疫組化(SP)染色。SP試劑盒、兔源性多克隆抗體均為Santa Cruz公司產(chǎn)品(抗體工作比例為1∶100)。3%H2O2-甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波(750W，95℃,5 min×2次)抗原修復(fù)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，HE復(fù)染。每批染色均設(shè)陽性對照和陰性對照，嚴格按SP試劑盒的說明進行染色。判斷標準：①按細胞顯色有無及深淺計分：0分，細胞無顯色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②.按細胞的顯色比例計分：0分，顯色細胞<10%；1分，10%～30%顯色；2分，31%～60%顯色；3分，60%以上顯色。每例積分=①×②。按積分高低分為：陰性(-)，計分為0分；弱陽性(+),積分1～4分；強陽性(),積分>4分。

1.5細胞凋亡原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL) 標本經(jīng)甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋，連續(xù)4 μm切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，嚴格按照TUNEL凋亡試劑盒說明書(In Situ cell Death Detection Kit, Fluorescein; Roche)，滴加TUNEL反應(yīng)液，溫箱孵育，滴加抗熒光淬滅劑，進行封片。

1.6統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進行分析，蛋白表達量及細胞凋亡率利用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1免疫組織化學及Western印跡檢測Cdc25c和(Caspase)-3的表達 圖1，圖2可見，Caspase-3在I/R組的表達高于S組并且I/R組明顯低于C組(P<0.05)。Caspase-3蛋白的陽性表達主要位于胞質(zhì)，呈黃色或者棕黃色顆粒。Caspase-3在缺血再灌注組中的陽性率明顯高于正常組(P<0.05)。通過上調(diào)Cdc25c基因表達，在肝臟缺血再灌注組中的Caspase-3表達明顯下降(P<0.05)。Cdc25c在S和C組明顯高于I/R組(P<0.05)。

圖1 Western印跡分析Cdc25c、Caspase 3在肝臟組織中的表達

圖2 免疫組織化學檢測Caspase 3在肝臟組織中的表達

2.2TUNEL 檢測肝細胞的凋亡 I/R組的凋亡比S組明顯升高(P<0.05)。而在C組凋亡較I/R明顯下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 TUNEL檢測肝細胞的凋亡

3 討 論

肝臟缺血再灌注是肝部分切除及肝移植的主要制約因素之一，是導致患者死亡的主要原因。是指各種原因?qū)е赂窝髦袛嗷蛘卟蛔闶垢闻K缺血，當恢復(fù)血供再灌注后，肝細胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重。凋亡是肝臟缺血再灌注損傷后細胞死亡的主要方式〔5～7〕。

細胞周期是細胞生命活動的基本過程。周期蛋白激酶是調(diào)控細胞周期網(wǎng)絡(luò)的核心。細胞周期中必需的Cdc25基因所表達的蛋白質(zhì)為Cdc25磷酸酶，它是細胞周期調(diào)控蛋白，在正常的細胞周期中具有重要的作用。Cdc25c基因位于染色體5q31,由14個外顯子和14個內(nèi)含子組成，全長約2 115 bp, 其cDNA的開放閱讀框架由1 419個核苷酸組成，編碼473個氨基酸。Cdc25c通過正反饋機制在調(diào)節(jié)細胞的有絲分裂〔1〕。當Cdc25c活性受抑制時，CDK1/周期蛋白B1復(fù)合物的活性也受將受抑制，G2期檢查點的總開關(guān)處于“關(guān)閉”狀態(tài)，發(fā)生G2/M期阻滯，進而導致細胞分裂停止，進而導致細胞的凋亡。

細胞周期調(diào)控機制的失活，特別是在G1/S期和G2/M期檢查點的失活，在細胞凋亡的過程中起重要作用，在人類的許多腫瘤中存在Cdc25c的過量表達。通過抑制Cdc25c的表達可以誘發(fā)細胞凋亡，從而有效的抗腫瘤增殖〔8～10〕。

本研究顯示凋亡蛋白Caspase-3在缺血再灌注組中的表達明顯高于正常組織;干預(yù)后Caspase-3的蛋白表達明顯降低和免疫組織化學結(jié)果一致。這可能由于通過ATM-Chk2途徑導致DNA損傷，進而導致細胞周期停止，進展導致細胞凋亡。這和Agarwal等〔11〕的報道一致。

Caspase-3是細胞凋亡的效應(yīng)分子，它在各種生理和病理因素刺激下，通過其家族成員的級聯(lián)放大，實施細胞的凋亡，引起細胞特征性的凋亡形態(tài)學上的改變，加重組織或者器官的功能損害。本研究提示Cdc25c具有抑制肝細胞凋亡和改善肝功能的作用，有利于預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷。然而要將之用于臨床，還要做進一步的深入研究。

4 參考文獻

1Aressy B, Ducommun B. Cell cycle control by the Cdc25 phosphatases〔J〕. Antic Agents Med Chem,2008;8(8):818-24.

2Donzelli M, Draetta GF. Regulating mammalian checkpoints through Cdc25 inactivation〔J〕. EMBO Rep,2003;4(7):671-7.

3Takizawa CG, Morgan DO. Control of mitosis by changes in the subcellular location of cyclin-B1-Cdk1 and Cdc25C〔J〕. Curr Opin Cell Biol,2000;12(6):658-65.

4Nilsson I, Hoffmann I. Cell cycle regulation by the Cdc25 phosphatase family〔J〕. Prog Cell Cycle Res,2000;4(1):107-14.

5Jaeschke H. Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning〔J〕. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2003;284(1):G15-26.

6Borghi-Scoazec G, Scoazec JY, Durand F,etal. Apoptosis after ischemia-reperfusion in human liver allografts〔J〕. Liver Transpl Surg,1997;3(4):407-15.

7Teoh NC, Farrell GC. Hepatic ischemia reperfusion injury: pathogenic mechanisms and basis for hepatoprotection〔J〕. J Gastroenterol Hepatol,2003;18(8):891-902.

8Kristjansdottir K, Rudolph J. Cdc25 phosphatases and cancer〔J〕. Chem Biol,2004;11(8):1043-51.

9Hernandez S, Bessa X, Bea S,etal. Differential expression of cdc25 cell-cycle-activating phosphatases in human colorectal carcinoma〔J〕. Lab Invest,2001;81(4):465-73.

10Molinari M, Mercurio C, Dominguez J,etal. Human Cdc25 A inactivation in response to S phase inhibition and its role in preventing premature mitosis〔J〕. EMBO Rep,2000;1(1):71-9.

11Agarwal C, Tyagi A, Agarwal R. Gallic acid causes inactivating phosphorylation of cdc25A/cdc25C-cdc2 via ATM-Chk2 activation, leading to cell cycle arrest, and induces apoptosis in human prostate carcinoma DU145 cells〔J〕. Mol Cancer Ther,2006;5(12):3294-302.