滕立新

(沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院泌尿外科，遼寧 沈陽 110024)

膀胱癌可發(fā)生于膀胱的各層組織，發(fā)病率居泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的首位〔1，2〕。研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌的侵襲和轉移與多基因調控導致其表達產物改變有關〔3〕。本研究觀察siRNA對T24細胞凋亡的影響和對Survivin基因沉默的效率及Survivin基因被沉默后對腫瘤細胞周期及其對塞來昔布的敏感性的影響。

1 材料和方法

1.1主要材料 膀胱癌T24細胞株購于中國科學院上海細胞究所。MI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清(美國Gibco公司)。Lipofectamine TM 2000脂質體轉染試劑和TRIzol(美國Invitrogen公司)；RT-PCR兩步法試劑盒(北京賽百盛基因技術有限公司)，cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉錄試劑盒(杭州博日)； siRNA基因片段由上海生工生物工程公司合成；G418(美國Klontech公司)；Survivin鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；5%四甲基偶氮唑藍、HRP標記的羊抗鼠二抗(北京中杉公司)；塞來昔布、流式細胞儀(COULTER XL;Coulter)；550酶標儀(美國Biorad公司)，生物倒置顯微鏡(Olympus CKX4)。ECL試劑盒(美國Thermo公司)；RIPA蛋白裂解液(江蘇碧云天公司)。

1.2siRNA設計、合成及轉染 根據(jù)Genebank中 Survivin cDNA(Acc.No.U75285)的序列,通過相應計算機軟件設計靶向Survivin mRNA 45～65序列，由21個堿基組成的核苷酸鏈,其序列為:5'-GG ACCACCGCAUCUCUACADTDT-3',同時合成互補鏈,經退火形成雙鏈(dsRNA),即特異性 的siRNA分子，經BLAST查詢,確定為Survivin特性序列,排除與其他基因的同源性。陰性對照 siRNA的序列為:5'-CGUACGCGGAAUACUUCG ADTDT-3',此序列不與人類任何基因序列同源。以上核苷酸分子均由上海生工生物工程公司合成。膀胱癌細胞株T24培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置飽和濕度5% CO2，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天傳代1次，實驗時取對數(shù)生長期的細胞。按1× 105個/孔將膀胱癌T24細胞接種于24孔板中，至融合率達70%時以脂質體法進行轉染。按基因轉染試劑盒說明書進行轉染，轉染時分為三組：轉染pGenesil-1-Survivin-siRNA載體者為T24/Survivin-siRNA組(實驗組)，轉染隨機對照載體者為T24/control組(對照組)，未轉染的膀胱癌T24細胞為T24組(空白組)。于轉染后48 h行 RNA 干擾效應的檢測。

1.3RT-PCR檢測 細胞棄培養(yǎng)液后磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，通過TRIzol法提取總RNA，用cDNA合成試劑盒反轉錄合成cDNA。分別擴增Survivin和內參GAPDH。Survivin引物序列:正義：5＇-CACCGCATCTCTACATTCAA-3＇，反義：5＇-CACTTTCTTCGCAGTTTCCT-3＇，擴增產物為345 bp。GAPDH 正義：5＇-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3＇，反義：5＇-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3＇，擴增產物為185 bp。PCR反應條件：95℃預變性10 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)。PCR產物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行吸光度掃描并用Survivin吸光度/GAPDH吸光度值作為mRNA表達的相對強度。

1.4Western印跡檢測 細胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，加入預冷的RIPA裂解液150 μl，RIPA裂解液預先加PMSF 1.5 μl使其終濃度為1 mmol/L。操作在冰上進行，4℃下，10 000 r/min離心5 min后取上清液，通過BCA法測蛋白濃度后，99℃ 變性10 min。取50 μg蛋白行10%SDSPAGE電泳，通過電轉移印跡到(PVDF)膜上，封閉液中孵育1 h，加入1∶1 000稀釋的Survivin一抗，4℃過夜，TBST洗膜5 min,共3次，加入1∶5 000 HRP標記的二抗和GAPDH,于37℃孵育2 h。PBS洗滌，采用ECL法檢測。

1.5流式細胞儀檢測細胞周期 收集三組細胞，調整細胞濃度為1×106/L，冷PBS液洗滌2次,加入70%的冷乙醇(4℃)固定24 h后，洗滌細胞，與含10 μg/ml RNA 酶的Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)共同孵育30 min。50 μg/ml碘化丙啶(PI)進行細胞的DNA染色，1 h內通過流式細胞儀分析細胞的DNA含量分布，并計算出各個周期細胞所占的百分率。

1.6MTT檢測干擾Survivin后T24細胞對塞來昔布的敏感性 細胞轉染干擾質粒48 h后，收集轉染和未轉染的T24細胞細胞，接種于96孔板 ，每個樣本做3個復孔，當細胞貼壁后，加入不同濃度的塞來昔布(2.5、5、10 、20 μmol/L)培養(yǎng)48 h；每孔加MTT 20 μl(濃度為5 mg/ml)，放置孵箱內4 h后棄上清加入10%的十二烷基磺酸鈉(SDS)200 μl，過夜。震蕩15 min，用全自動酶標儀(檢測490 nm處的吸光度值(A值)。抑制率(%)=(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)×100%。

1.7平板克隆檢測干擾Survivin后T24對塞來昔布的敏感性 細胞轉染干擾質粒48 h后，收集轉染和未轉染的T24細胞，接種于6孔板 ，每個樣本做3個復孔，細胞貼壁后，加入不 同濃度的塞來昔布(2.5、5、10 、20 μmol/L)培養(yǎng)中培養(yǎng)7 d，去除培養(yǎng)液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆薩染液染色10 min，自來水沖洗后，晾干，通過Quantity One軟件計算克隆數(shù)。克隆形成抑制率(%)=1-(實驗組克隆數(shù)/對照組克隆數(shù))×100%。

2 結 果

2.1siRNA抑制Survivin mRNA的表達 Survivin mRNA表達的RT-PCR檢測與對照組和空白組比較，實驗組條帶明顯變窄(P<0.05)。見圖1。

2.2siRNA抑制Survivin蛋白的表達 Survivin蛋白表達的Western印跡檢測與對照組和空白組比較，T24/Survivin-siRNA組(實驗組)條帶明顯變窄(P<0.05)。見圖2。

2.3流式細胞儀檢測細胞周期 在G0/G1期實驗組較對照組和空白組略有增加，S期略有減少(P<0.05)，G2/M期細胞無明顯變化(P>0.05)，說明有明顯的S期阻滯。見表1。

Marker 空白組 對照組 實驗組

圖2 Western印跡檢測T24細胞中Survivin蛋白的表達

表1 siRNA抑制Survivin表達對T24細胞周期的影響

與空白組及對照組比較：1)P<0.05

2.4細胞轉染后塞來昔布對T24細胞填殖抑制率 MTT法檢測結果顯示，在轉染pgsiRNA-Survivin后，T24細胞對不同濃度的塞來昔布敏感性均提高 。隨著藥物濃度的增加，塞來昔布對細胞的抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，實驗組細胞對不同濃度的塞來昔布敏感性顯著高對照組和空白組(P均<0.05)。見表2。

2.5細胞轉染后對T24細胞集落形成的影響 平板克隆檢測顯示，轉染 pgsiRNA-Survivin后，T24細胞對不同濃度的塞來昔布敏感性均提高，細胞克隆形成數(shù)明顯減少，克隆形成抑制率明顯增高(P<0.05 )。隨著藥物濃度的增加，塞來昔布對細胞的克隆形成抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴性，實驗組細胞對不同濃度的塞來昔布克隆形成抑制率顯著高于對照組和空白組(P均<0.05 )。見表3。

表2 MTT法檢測細胞轉染后塞來昔布對T24細胞增殖的抑制率

表3 平板克隆檢測細胞轉染后塞來昔布對T24細胞克隆形成抑制率

3 討 論

膀胱癌高發(fā)年齡為50～69歲，男女比例為3∶4。膀胱癌病理與腫瘤的組織類型、細胞分化程度、生長方式和浸潤程度有關，其中以細胞分化和浸潤程度最為重要。膀胱癌的組織病理類型有90%以上為移行性細胞癌，其生物學行為復雜多變，易復發(fā)、浸潤和轉移〔4，5〕。膀胱癌細胞的遠處轉移要經歷一個多因素、多步驟、多階段的復雜過程,其中細胞轉移及侵襲是關鍵步驟。目前通過腫瘤特異性啟動子增強細胞中治療基因的轉錄選擇性是有效治療腫瘤的方法之一〔6，7〕。Survivin基因具有腫瘤組織表達特異性.在多數(shù)腫瘤組織中高表達，在癌旁組織及正常組織中無或低表達，是腫瘤基因治療理想的靶點。已有研究表明Survivin的表達與組織病理分級、臨床分期密切相關〔8〕。Survivin過表達會導致細胞加快向s期轉換，抑制G1期靜止，從而促進細胞增殖。研究〔9〕顯示Survivin主要通過作用于各個凋亡途徑的交合點直接或間接抑制凋亡終末效應器半胱氨酸蛋白酶Caspase-3及Caspase-7的活性來阻斷細胞的凋亡過程，使Caspase-3不能降解微管結構蛋白，維持了紡錘體的完整性，可以確保胚胎細胞有絲分裂的順利進行，而在腫瘤組織中Survivin過度表達，使腫瘤細胞不斷分裂，惡性增殖永生化，使腫瘤持續(xù)生長。因此針對Survivin干預腫瘤生長有著很大的潛力。有研究證實Survivin在膀胱移行細胞癌組織中有高表達〔10〕。

塞來昔布是一種選擇性COX-2抑制劑，能抑制多種實體腫瘤細胞增殖，并誘導細胞凋亡〔11～13〕。塞來昔布不僅對多種類型的腫瘤細胞均有抑制生長并誘導凋亡的作用，而且能夠增強化療藥物的抗腫瘤活性。塞來昔布使細胞的生存率降低，同時可激活Caspase級聯(lián)反應，增加DNA的裂解,抑制Caspase-8的表達，從而誘導不同腫瘤細胞株的凋亡。

有資料〔14〕顯示，通過siRNA干擾誘導切除修復交叉互補基因(ERCC1)使Survivin表達下調可以增加膀胱癌等腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。本實驗結果說明Survivin即可以直接有效降低細胞分裂增殖，也可以增加膀胱癌細胞對化療藥物的敏感性，是重要的細胞凋亡因子，可以作為腫瘤基因治療的靶點。本實驗結果提示小分子Survivin干擾RNA沉默Survivin基因能夠增加膀胱癌細胞對化療藥物的敏感性，可以為治療或輔助治療膀胱癌提供一個新的手段。

4 參考文獻

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