張江華 陳志強(qiáng) 趙雯紅 孫玉鳳 王月華 李黎莉 王鳳麗 楊增芯

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，河北 石家莊 050017)

糖尿病腎病 (DN)是糖尿病(DM)全身微血管并發(fā)癥之一。在DM中的發(fā)病率高達(dá)47.66%，是造成慢性腎衰竭的常見病因，占DM患者死亡率的60%，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)〔1〕。迄今為止，尚無(wú)有效的方法能夠防止其發(fā)生和惡化。課題組針對(duì)DN的病因病機(jī)，提出了益氣養(yǎng)陰、消牴通絡(luò)治療大法，臨床取得了較好療效，顯示了較好的腎臟保護(hù)作用〔2～5〕，本研究進(jìn)一步探討其防治DN的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠， 110只， SPF級(jí)，體重為(250±20)g，動(dòng)物一般狀態(tài)良好，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證編號(hào)：905042。益氣養(yǎng)陰、消牴通絡(luò)中藥(由黃芪、積雪草、丹參、茯苓、熟地、地龍、水蛭、鱉甲、大黃、砂仁等組成)，由河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省中醫(yī)院中藥房提供。符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn)(2000年版)，中藥湯劑由本實(shí)驗(yàn)室制備，濃縮至含生藥1 g/ml，分裝滅菌， 4℃保存?zhèn)溆?。厄貝沙坦?安博維)，150 mg/片，杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0809155。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司。反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒、Taq酶、dNTP(Fermentas公司)。大鼠Podocin引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。代謝籠(蘇州工業(yè)園唯亭姑秀動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；OneTouchUltraⅡ穩(wěn)豪型血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)；全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)；電子天平(德國(guó)賽多利電子天平有限公司)；PCR儀(英國(guó)ThorhnoHybaid公司)；三洋低溫冰箱(日本三洋電機(jī)株式會(huì)社)；電腦三恒電泳儀(北京六一儀器廠)；電子顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，分別測(cè)定尿蛋白陰性后腹腔注射1%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，常規(guī)備皮消毒，經(jīng)背部切口行左腎切除術(shù)，并于傷口處滴0.01 ml慶大霉素以預(yù)防感染。2 w后除腎切組外，剩余大鼠腹腔注射STZ(40 mg/kg)，將其溶于0.1 mol/L，pH 4.4的枸櫞酸緩沖液中)， 72 h后尾靜脈取血，血糖大于16.7 mmol/L為造模成功〔6〕。

1.2.2動(dòng)物分組及給藥方法 隨機(jī)抽取10大鼠只為單純腎切組，其余100只制備模型。造模期間有8只大鼠死亡，4只大鼠血糖偏低，從實(shí)驗(yàn)中剔除。造模成功的88只隨機(jī)分為5組：模型組24只、厄貝沙坦組16只、中藥低劑量組16只、中藥中劑量組16只、中藥高劑量組16只。厄貝沙坦組大鼠給予厄貝沙坦15 mg·kg-1·d-1灌胃，中藥低、中、高劑量組大鼠分別給予中藥5.29、10.58、21.16 g·kg-1·d-1灌胃，余組給予等劑量生理鹽水灌胃藥物劑量換算按體表面積換算〔7〕，每日灌胃1次。動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，室溫18℃～20℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h交替照明，共給藥6 w。實(shí)驗(yàn)期間每天測(cè)量1次尾靜脈血糖，對(duì)血糖≥26.0 mmol/L可能危及生存的大鼠皮下注射適量長(zhǎng)效胰島素(0.5～4 U)，使血糖維持在16.7 mmol/L以上，并避免酮癥，減少死亡。

1.2.324 h UPro及腎功能檢測(cè) 于第6周末用代謝籠留取24 h尿液，記錄總量，雙縮脲法檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白(UPro)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所用動(dòng)物于空腹?fàn)顟B(tài)稱體質(zhì)量，3%戊巴比妥鈉麻醉，股動(dòng)脈取血，全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)貝克曼公司)檢測(cè)血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；分離腎臟，用冰生理鹽水沖洗，吸干水分，稱腎質(zhì)量，計(jì)算腎臟肥大指數(shù)(腎質(zhì)量/體質(zhì)量)。腎皮質(zhì)液氮速凍后存放于-70℃冰箱，用于RT-PCR檢測(cè)。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)腎皮質(zhì)Podocin的表達(dá) 采用Trizol法提取腎皮質(zhì)總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。Podocin上游引物：5′-AGCGAATCAGCACCTACGGACTTC-3′，下游引物：5′- GGTTCCACTCCACCAGCCTTCTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為200 bp； 內(nèi)參照為GAPDH：上游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，下游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCA-TCAC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為452 bp。PCR反應(yīng)條件： 95℃ 5 min；94℃ 30 s；退火溫度分別為57.8℃、62.9℃ 30 s，72℃30 s；擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72℃ 7 min。取PCR產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值，以GAPDH基因表達(dá)量為內(nèi)參照，以目的產(chǎn)物與GAPDH的灰度比值表示mRNA相對(duì)含量。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 腎切組大鼠精神良好，飲食正常，反應(yīng)靈敏，皮毛光澤，肌肉豐滿，糞便呈麥粒狀，尿量正常。其余組注射STZ后，均出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿癥狀，并逐漸出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，少動(dòng)抱團(tuán)，部分大鼠出現(xiàn)全身感染、潰瘍等并發(fā)癥。其中12只大鼠血糖未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)，剔除。上述癥狀以模型組最為顯著。治療期間造模各組均有大鼠死亡情況，其中中藥低劑量組死亡3只，中藥高、中劑量、厄貝沙坦組各死亡4只，模型組死亡10只，死亡原因估計(jì)為高血糖引起的代謝紊亂最終導(dǎo)致臟器衰竭。

2.2各組大鼠24 hUPro的比較 與單純腎切組〔(8.05±1.20)mg/24 h〕比較，模型組、各治療組UPro升高(P<0.05)；與模型組〔(54.75±11.16)mg/24 h〕比較，厄貝沙坦、中藥低、中劑量組UPro下降〔(24.33±8.43)mg/24 h、(26.71±7.36)mg/24 h、(33.36±5.32)mg/24 h，P<0.05〕，中藥高劑量組UPro無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(64.12±3.18)mg/24 h，P>0.05〕，厄貝沙坦、中藥低、中劑量組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明厄貝沙坦、中藥低、中劑量可顯著降低糖尿病大鼠24 h UPro，且三組之間無(wú)明顯差別。

2.3各組大鼠腎功能的比較 與單純腎切組比較，模型組Scr、BUN值升高(P<0.01)，各治療組Scr值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，BUN值升高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組Scr值下降(P<0.05)，中藥低、高劑量組BUN值下降(P<0.05)，余組BUN值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明厄貝沙坦和各劑量中藥對(duì)DN大鼠的腎功能損害均有明顯的改善作用。見表1。

2.4對(duì)大鼠腎臟Podocin mRNA表達(dá)的影響 與單純腎切組比較，模型組Podocin表達(dá)下降(P<0.05)，其余組無(wú)顯著差異(P>0.05)。與模型組比較，中藥低劑量組Podocin表達(dá)顯著增加 (P<0.01)；中劑量組、厄貝沙坦組Podocin表達(dá)均上升(P<0.05)；說(shuō)明厄貝沙坦、中藥中、低劑量組可上調(diào)Podocin mRNA表達(dá)。見圖1，表2。

表1 各組Scr、BUN水平的比較

1.腎切組； 2.模型組； 3.厄貝沙坦組； 4.中藥低劑量組； 5中藥中劑量組； 6.中藥高劑量組

表2 各組大鼠腎臟Podocin mRNA表達(dá)

3 討 論

DN是DM病人死亡的主要原因，大量蛋白尿的發(fā)生是DM腎組織損傷的典型標(biāo)志。目前已經(jīng)形成共識(shí)，即UPro的發(fā)生與腎小球?yàn)V過(guò)屏障異常有密切關(guān)系。腎小球?yàn)V過(guò)屏障包括三層：內(nèi)皮細(xì)胞窗孔、腎小球基底膜(GBM) 以及位于臟層上皮細(xì)胞足突之間的裂孔隔膜。而裂孔隔膜是濾過(guò)屏障中最主要的部位，可以阻止絕大部分蛋白質(zhì)漏出到原尿中，故與蛋白尿的發(fā)生密切相關(guān)〔8〕。近年來(lái)已經(jīng)先后確定了多個(gè)由足細(xì)胞表達(dá)、對(duì)維持正常裂孔隔膜功能十分重要的分子成分。其中Podocin是2000年Boute等〔9〕通過(guò)定位克隆技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)的新發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的整合膜蛋白，由NPHS2基因編碼，以寡聚體的形式特異性地表達(dá)于足細(xì)胞SD處。除了作為正常足細(xì)胞SD的一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，也有研究發(fā)現(xiàn)Podocin集中位于足突之間的緊密連接位點(diǎn)上，可能發(fā)揮一種支架的作用將緊密連接蛋白與足細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白相連〔10〕。因此觀察足細(xì)胞Podocin變化對(duì)于糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。

DN屬于中醫(yī)學(xué)“消渴病”、“腎消”、“虛勞”、“水腫”、“關(guān)格”等范疇， 目前對(duì)于DN的病機(jī)認(rèn)識(shí)主要是認(rèn)為本病為本虛標(biāo)實(shí)之證，以脾腎及氣血陰陽(yáng)之虛為本，氣滯、濕阻、血瘀、痰聚為標(biāo)。腎為先天之本，主藏精，司固攝而寓元陰元陽(yáng)，脾虛日久累及腎元，腎失固攝，則水谷精微下泄，臨床表現(xiàn)為蛋白尿及尿糖增高。氣為血帥，氣行血行，氣滯則血瘀、津停，痰瘀互結(jié)，瘀阻脈絡(luò)，久釀成牴積是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。故擬益氣養(yǎng)陰、消牴通絡(luò)中藥復(fù)方為治療DN的基礎(chǔ)方，該中藥復(fù)方經(jīng)臨床及實(shí)驗(yàn)研究證明療效確切〔11，12〕。其中黃芪益氣，走而不守，配伍茯苓、砂仁、熟地，氣陰兼顧，健脾益氣，補(bǔ)腎斂精，利水消腫；水蛭性緩則氣血不傷，善入則堅(jiān)積易破，配伍地龍、鱉甲，活血祛瘀，散結(jié)軟堅(jiān)；大黃同煎，可通腑泄熱，蕩滌積滯，使?jié)嵝皬南赂[而出；積雪草有清熱利濕、消腫解毒之功效。諸藥合用，共奏補(bǔ)脾益腎，益氣養(yǎng)陰，活血化瘀，利水泄?jié)嶂Γ狗稣涣粜?，祛邪不傷正。另?yè)?jù)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰、消牴通絡(luò)中藥〔13～16〕能改善腎小球?yàn)V過(guò)屏障，減輕通透性蛋白尿，抑制血栓形成，降低血小板黏附率，改善DN的血液流變學(xué)，延緩DN的發(fā)展，保護(hù)腎功能。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中藥中、低劑量可顯著減少DN大鼠尿蛋白，各劑量均能降低Scr、BUN水平，與厄貝沙坦比較降UPro作用相當(dāng)，改善腎功能略好，需進(jìn)一步研究二者的協(xié)同效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)提示益氣養(yǎng)陰、消牴通絡(luò)中藥可能通過(guò)減少Podocin蛋白的丟失，使腎小球?yàn)V過(guò)膜的完整性得到一定程度的恢復(fù)而減輕蛋白尿，但中藥短期干預(yù)無(wú)劑量依賴性，其長(zhǎng)期療效發(fā)揮有待進(jìn)一步研究。

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