葛 敏 劉國(guó)平 關(guān)宿東

(蚌埠醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,安徽 蚌埠 233003)

阿霉素(ADR)被廣泛用于治療實(shí)質(zhì)性及血液系統(tǒng)惡性腫瘤，但隨著劑量的增加患者常伴有擴(kuò)張型心肌病和充血性心力衰竭〔1,2〕,且預(yù)后很差，因而臨床應(yīng)用受到限制。絞股藍(lán)屬于葫蘆科絞股藍(lán)屬植物，其主要藥效成分為絞股藍(lán)總皂苷(GP)。GP具有較強(qiáng)的抗氧化、抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載〔3,4〕等多種藥理作用。本研究旨在探討GP對(duì)ADR致心力衰竭大鼠心臟功能的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠50只，體重(232±13)g，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 GP(純度90%)，購(gòu)于惠州綠源公司；鹽酸ADR：浙江海正藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)：070501)。ATPase試劑盒、琥珀酸脫氫酶(SDH)試劑盒和Ca2+-ATPase試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RT-PCR試劑盒：寶生物(大連)有限公司；Trizol 100ml/瓶：Invitrogen公司；Tris-HCl購(gòu)自美國(guó)Promega公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3動(dòng)物模型制備 大鼠隨機(jī)分為五組，即正常對(duì)照組(NC)，ADR組,GP低、中、高劑量(L-GP、M-GP、H-GP)組，每組10只。具體處理如下：ADR給藥方法：除NC組外，其余各組均腹腔注射ADR，2.5 mg/kg體重，隔日1次，共6次，累積劑量15 mg/kg體重，NC組給予等容量的生理鹽水腹腔注射，隔日1次，共6次；GP給藥方法：GP低、中、高劑量組分別在注射ADR半小時(shí)前給予0.5%、1%、2%GP 10 ml·kg-1·d-1灌胃，共6 w；對(duì)照組等量的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)6 w。

1.4心功能測(cè)定 實(shí)驗(yàn)第7周，20%烏拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，肝素化(1%肝素1 ml/kg股靜脈注入)，手術(shù)游離出右側(cè)頸總動(dòng)脈，經(jīng)其插入自制的心室插管(直徑1 mm，充滿1%肝素)，描記血壓曲線；再繼續(xù)插入左心室，描記室內(nèi)壓曲線，自動(dòng)分析處理左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)等數(shù)據(jù)。

1.5心肌組織ATPase和SDH活性測(cè)定 取其左心室肌，標(biāo)本放置-80℃冰箱保存。心肌勻漿測(cè)定ATPase活性和SDH活性，蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.6心肌肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA2a)活性測(cè)定 ①心肌SR制備：按文獻(xiàn)〔5〕的方法制備心肌SR膜：取定量左心室組織置于4℃勻漿液(NaHCO310 mmol/L，NaN35 mmol/L，Tris-HCl 15 mmol/L，pH6.8)進(jìn)行勻漿,經(jīng)離心(9 500 r/min，20 min)去除細(xì)胞碎片，上清液再離心(19 000 r/min，45 min)，將沉淀懸浮于緩沖液(KCl 600 mmol/L，Tris-HCl 10 mmol/L，pH6.8)中離心(19 000 r/min，45 min)，沉淀即為SR膜，懸浮于緩沖液(sucrose 250 mmol/L，histidine 1 mmol/L)。②心肌肌漿網(wǎng)蛋白測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)法。心肌SERCA2a活性測(cè)定：采用無(wú)機(jī)磷酸根法。

1.7心肌超微結(jié)構(gòu)觀察 大鼠處死時(shí)，取心尖部切成1 mm3小塊，2.5%戊二醛固定，電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)變化。

1.8逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶(RT-PCR)半定量測(cè)定SERCA2a mRNA的表達(dá) ①引物設(shè)計(jì) β-actin(285 bp)：上游引物5′-TCATGAAGTGTGACGTTGA CATC CGT-3′,下游引物5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGCA CGATG-3′；SERCA2a(134 bp)：上游引物5′-AAGCAGTTCATCCGCTACCT-3′，下游引物5′-AGACCATCCGTCACCAGATT-3′，均由上海生工合成。②RT-PCR反應(yīng)：取100 mg 組織采用Trizol 法提取心肌組織總RNA。反應(yīng)體系20 μl ，包括10×PCR緩沖液2 μl，MgCl24 μl，dNTP(各10 mmol/L)2 μl，去DEPC水7.5 μl，Random 9 mers 1 μl, RNA酶抑制劑(40 U/μl) 1 μl，RNA 2 μl。反應(yīng)條件:30℃10 min，50℃20 min，94℃5 min，5℃5 min然后進(jìn)入PCR 循環(huán)，PCR反應(yīng)體系40 μl：Taq 酶0.5 μl，上下游引物各0.5 μl，去DEPC水28.75 μl，5×PCR緩沖液10 μl；94℃預(yù)變性2 min，94℃30 s，60℃30 s, 72℃2 min，循環(huán)30次。取PCR 產(chǎn)物5 μl于2 %瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像系統(tǒng)上掃描，測(cè)定SERCA2a mRNA和β-actin mRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的吸光度值，分別計(jì)算其比值。

2 結(jié) 果

2.1血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的變化 與NC組相比，ADR組LVSP和±dP/dtmax均明顯下降，LVEDP上抬(P<0.05)，提示ADR致大鼠慢性心力衰竭模型成功，ADR組大鼠發(fā)生心肌損傷；與ADR組相比，GP各組LVSP和±dP/dtmax均有升高，其中M-GP、H-GP組LVSP和±dp/dtmax均顯著升高(P均<0.01)，LVEDP顯著下降 (P均<0.01)，表明中、高劑量GP對(duì)ADR致心臟毒性有較好的保護(hù)作用，可明顯改善心力衰竭大鼠的心臟收縮與舒張功能。見(jiàn)表1。

2.2心肌組織ATPase活性和SDH活性的變化 與NC組相比，ADR組心肌ATPase活性和SDH活性明顯下降(P<0.01)。GP中、高劑量組與ADR組比較，心肌組織中ATPase活性和SDH活性均升高(P<0.05，P<0.01)。與NC組相比，GP各組心肌組織中ATPase活性和SDH活性比較差異有顯著性(P<0.05，P<0.01) 。見(jiàn)表1。

2.3心肌超微結(jié)構(gòu)變化 NC組：肌小節(jié)Z線排列整齊；線粒體形狀規(guī)則，嵴豐富，排列規(guī)則；細(xì)胞核完整。ADR組：心肌細(xì)胞內(nèi)肌原纖維斷裂、溶解，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張，肌小節(jié)失去正常結(jié)構(gòu)；線粒體水腫，嵴減少或消失，甚至空泡變。L-GP組：心肌肌原纖維尚整齊，部分橫紋不清；線粒體腫脹變性和局限性增多，部分嵴斷裂和溶解。M-GP組：肌小節(jié)灶性溶解，斷裂，部分橫紋模糊不清；肌漿網(wǎng)輕度擴(kuò)張；線粒體大小不一，部分線粒體輕度水腫。H-GP組：心肌病變明顯減輕，肌原纖維排列整齊，無(wú)溶解、壞死等病變，僅部分線粒體水腫、空泡變。見(jiàn)圖1。

2.4心肌組織SERCA2a活性和SERCA2a mRNA表達(dá)的變化 與NC組相比，其余各組SERCA2a活性和SERCA2a mRNA表達(dá)均有顯著性下降(P<0.01)；與ADR組相比，M-GP和H-GP組SERCA2a活性和SERCA2a mRNA表達(dá)均增加(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖2和表2。

表1 GP對(duì)ADR中毒大鼠心功能、心肌組織SDH活性和ATPase活性的影響±s)

圖1 各組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)(×12 000)

M:Marker；A：NC組；B：ADR組；C：L-GP組；D：M-GP組；E：H-GP組

表2 GP對(duì)ADR中毒大鼠心肌SERCA2a酶活性和mRNA表達(dá)的影響±s)

3 討 論

ADR最明顯的副作用之一是劑量依賴的不可逆轉(zhuǎn)的心肌病伴有充血性心力衰竭的擴(kuò)張型心肌病〔1,2〕。ADR致心臟毒性具體機(jī)制尚不完全清楚，研究表明主要與脂質(zhì)過(guò)氧化增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)鈣超載及細(xì)胞凋亡有關(guān)。實(shí)驗(yàn)觀察到，ADR中毒后，其功能及形態(tài)學(xué)上的改變，可能是ADR使氧自由基生成增多，細(xì)胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化，造成質(zhì)膜損傷，無(wú)法形成正常肌小節(jié)，對(duì)心肌細(xì)胞膜完整性具有損害作用〔5〕，從而損傷心肌收縮和舒張功能。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)異常是心力衰竭患者心室收縮和舒張功能降低的主要原因，胞漿內(nèi)鈣的超負(fù)荷可引起心肌收縮和舒張功能的異常。由于心肌線粒體內(nèi)膜富含心磷脂，其DNA缺少組蛋白的保護(hù)，因而更易于受到氧自由基的攻擊而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和功能損傷。線粒體是能量代謝的重要場(chǎng)所，ATP的產(chǎn)生和儲(chǔ)存在線粒體進(jìn)行，心肌細(xì)胞幾乎全賴有氧代謝產(chǎn)生ATP以供細(xì)胞生存及做功的需要。當(dāng)線粒體生成ATP減少，可導(dǎo)致ATP依賴性酶功能障礙。ADR可直接抑制Na+-K+-ATP 酶活性，使Na+-K+交換減少，Na+-Ca2+交換增加，從而增加鈣內(nèi)流，誘發(fā)鈣超載〔6〕。在心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)中，SERCA2a起主要作用。心肌細(xì)胞收縮期間釋放到胞質(zhì)的鈣離子60%～90%是由SERCA2a轉(zhuǎn)運(yùn)入肌漿網(wǎng)內(nèi)儲(chǔ)存〔7〕，由于大部分Ca2+由SERCA2a攝入肌漿網(wǎng)，導(dǎo)致心肌舒張，并為下一次收縮儲(chǔ)備Ca2+，因此SERCA2a在心肌舒、縮中起重要作用。肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase表達(dá)減低，鈣泵對(duì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的攝取下降，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超負(fù)荷，心肌細(xì)胞不能有效地舒張〔8〕。SERCA2a表達(dá)的增高使Ca2+能在舒張期更快地回泵入肌漿網(wǎng)，從而加速心肌舒張的速度和心室總體舒張功能，使舒張末期壓降低，減少心肌的壓力和容量過(guò)負(fù)荷。ADR致心衰時(shí)，細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期處于Ca2+超載狀態(tài)，細(xì)胞對(duì)Ca2+不敏感，導(dǎo)致收縮功能降低〔9,10〕。

本研究結(jié)果顯示GP給予預(yù)防性處理后，中、高劑量組大鼠心臟功能明顯改善，超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。進(jìn)一步研究表明GP可能通過(guò)增加SERCA2a mRNA的表達(dá)，而增加SERCA2a活性；也可以抑制Ca2+內(nèi)流〔3〕，從而調(diào)節(jié)了心肌細(xì)胞的鈣穩(wěn)態(tài)；通過(guò)提高心肌組織ATPase活性、SDH活性而改善ADR對(duì)心功能的影響。綜上，GP是通過(guò)其抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用，增加SERCA2a mRNA的表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載起到保護(hù)作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

4 參考文獻(xiàn)

1Swain SM, Whaley FS, Ewer MS. Congestive heart failure in patients treated with doxorubicin a retrospective analysis of three trial〔J〕.Cancer,2003; 97(11): 2869-79.

2楊冬花,付 蓉,羅建華,等.心力衰竭大鼠不同時(shí)期血漿內(nèi)皮素-1、降鈣素基因相關(guān)肽及神經(jīng)肽Y水平變化及益氣溫陽(yáng)活血方對(duì)其影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012;32(21)：4668-70.

3趙 穎，胡大一．絞股藍(lán)總皂苷對(duì)單個(gè)豚鼠心室肌細(xì)胞的鈣、鈉、鉀電流及動(dòng)作電位的影響〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1998;14(1): 60-2.

4韋登明,饒廣勛,張建明.絞股藍(lán)總甙對(duì)大鼠腦局灶性缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)觀察〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2004;24(11):1046-8.

5Wallac KB. Doxorubicin induced cardiac mitochondrionopathy〔J〕. Pharmacol Toxicol, 2003;93(3):105-15.

6Huang XM, Zhu WH, Kang ML. Study on the effect of doxorubicin on expressions of genes encoding myocardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+transport myocardiac protection in rabbits 〔J〕 .J Zhejiang Univ Sci, 2003;4 (1):114-20.

7Chossat N, Griscelli F, Jourdon P,etal. Adenoviral SERCA1a gene transfer to adult rat ventricular myocytes induces physiological changes in calcium handling 〔J〕. Cardiovasc Res,2001;49(2):288-97.

8鐘 明,張 薇,卜培莉,等.肌漿網(wǎng)鈣泵和磷酸受納蛋白在舒張性心衰患者中的表達(dá)〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2002;22(3):209-11.

9Li MX, Tian GZ, Ou YT,etal. The establishment of a chronic heart failure model by adrinmycin and judgment of the indexes〔J〕.Am Nat Res, 2005;27(3):176-8.

10Matin E, Thougaard AV, Grauslund M,etal. Evaluation of the topoisomerase Ⅱ-inactive bisdioxopiperazine ICRF-161 as a protectant against doxorubicin-induced cardiomyopathy 〔J〕.Toxicology,2009;255(1/2):72-9.