1.普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所,云南 普洱 665000;2.普洱市食品藥品檢驗(yàn)所,云南 普洱 665000

民族藥復(fù)方美登木片微生物限度檢查結(jié)果與分析

付開聰1趙琪忠2

1.普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所,云南 普洱 665000;2.普洱市食品藥品檢驗(yàn)所,云南 普洱 665000

微生物限度檢查是用于判斷非規(guī)定滅菌制劑及原料、輔料是否符合藥典規(guī)定和指導(dǎo)研發(fā)制劑、原料、輔料微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。筆者就民族藥復(fù)方美登木片研發(fā)過程中微生物限度檢查驗(yàn)證的結(jié)果作一分析,以供同行參考。

傣族拉祜族藥;復(fù)方美登木片;微生物限度檢查

復(fù)方美登木片是普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所在挖掘整理民族民間醫(yī)藥過程中，篩選出來的民族藥驗(yàn)方。源于傣族方記《檔哈雅帕雅摩雅召片領(lǐng)景帕罕》(傣族宮庭內(nèi)土司醫(yī)生扎康郎香的醫(yī)書——宮廷秘方集)，應(yīng)用歷史達(dá)500多年(此書未整理出版)。經(jīng)臨床觀察與驗(yàn)證，此方具有軟堅(jiān)散結(jié)，消腫止痛的功效。目前，已成當(dāng)?shù)匕傩占盎颊哂糜谥委熑橄傩∪~增生、前列腺增生及癌癥化療后的輔助用藥。此藥不僅療效較好，成本低廉，而且來自于民間，起源于古代，深得百姓、患者和醫(yī)生的親睞，值得深入研究。

1 復(fù)方美登木片微生物限度檢驗(yàn)方法步驟

1.1 陽性對照菌液的制備

1.1.1 試驗(yàn)菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

1.1.2 對照菌液 上述陽性菌分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間，取培養(yǎng)物用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋成每1ml含菌數(shù)約為50～100cfu的陽性對照菌液備用。

1.2 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證(常規(guī)法)

1.2.1 陽性對照菌液組 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌,、枯草芽孢桿菌對照液分別注入平皿(每種2個(gè)平皿)，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。

1.2.2 供試品組 取復(fù)方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個(gè)稀釋級2個(gè)平皿)傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。結(jié)果見表1。

1.2.3 試驗(yàn)組(供試品加陽性對照菌液組) 取復(fù)方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個(gè)稀釋級2個(gè)平皿)分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌對照菌液1ml，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。結(jié)果見表1。

2 霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證(常規(guī)法)

2.1 陽性對照菌液組 取白色念珠菌液各1ml分別注入平皿(2個(gè)平皿)，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。

2.2 供試品組 取復(fù)方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個(gè)稀釋級2個(gè)平皿)傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻后25℃培養(yǎng)72h,計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。

2.3 試驗(yàn)組(供試品加陽性對照菌液組) 取復(fù)方美登木片(批號：090401)1∶10、1∶100、1∶1000的供試液各1ml 分別注入平皿(每個(gè)稀釋級2個(gè)平皿)分別加入白色念珠菌對照菌液1ml，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方美登木片細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證表(常規(guī)法)

回收率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù))÷菌液組的平均菌落數(shù)(%)

3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)法的驗(yàn)證(培養(yǎng)基稀釋法)

通過以上對細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)法(常規(guī)法)的驗(yàn)證，可看出1∶10、1∶100、1∶1000的供試液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均有抑菌作用，但通過稀釋就可以降低抑菌活性，故擬先用培養(yǎng)基稀釋法，并對該法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

3.1 陽性對照菌液制備

3.1.1 試驗(yàn)菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

枯草芽孢桿菌(Bacilus subtilis)[CMCC(B)63501]

白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]

3.1.2 對照菌液 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

取經(jīng)23～28℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml，加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

3.2 陽性對照菌液組 取對照菌液各1ml，分別注入平皿(5個(gè)平皿)，傾注培養(yǎng)基培養(yǎng)后計(jì)數(shù)，結(jié)果見表2。

表2-1 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證表(培養(yǎng)基稀釋法)(批號：090401)

3.2.1 供試品組 取1∶1000的供試液1ml等量分別注入5個(gè)平皿(每平皿0.2ml)，傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基34℃培養(yǎng)48h后計(jì)數(shù)，結(jié)果見表2。

3.2.3 試驗(yàn)組(供試品組加陽性菌液組) 取1∶1000供試液1ml等量分別注入5個(gè)平皿(每平皿0.2ml),共3個(gè)批次，分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌對照菌液各1ml，傾注肉湯瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)，結(jié)果見表2。

表2-2 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證表(培養(yǎng)基稀釋法)(批號：090402)

表2-3 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證表(培養(yǎng)基稀釋法)(批號：090403)

從以上結(jié)果看出稀釋法消除了本品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的抑菌作用，可采用此方法對復(fù)方美登木片進(jìn)行微生物限度的細(xì)菌數(shù)檢查。

3.3 控制菌檢查方法的驗(yàn)證 取本品10g，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10的供試液備用。

3.4 陽性對照菌液的制備

3.4.1 實(shí)驗(yàn)菌種 大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

3.4.2 對照菌液 取經(jīng)30～35℃培養(yǎng)18～24h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌1ml加入9ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5～10-7約為50～100cfu/ml備用。

表3 對照菌液計(jì)數(shù)

3.5 大腸埃希菌檢查法的驗(yàn)證(培養(yǎng)基稀釋法)

3.5.1 試驗(yàn)組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,加入大腸埃希菌對照菌液1ml培養(yǎng)后取該培養(yǎng)物做MUG及靛基質(zhì)試驗(yàn)。結(jié)果均為陰性，未檢出大腸埃希菌。

3.5.2 陰性菌對照組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,加入金黃色葡萄球菌對照菌液1ml培養(yǎng)后取該培養(yǎng)物做MUG及靛基質(zhì)試驗(yàn)。結(jié)果均為陰性，未檢出陰性對照菌。

3.5.3 供試品組 取以上1∶10的供試液10ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)后取該培養(yǎng)物做MUG及靛基質(zhì)試驗(yàn)。結(jié)果均為陰性，未檢出大腸埃希菌。

3.5.4 試驗(yàn)組 取以上1∶1000的供試液2ml加入100ml無菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基中,加入大腸埃希菌對照菌液1ml培養(yǎng)后取該培養(yǎng)物做MUG及靛基質(zhì)試驗(yàn)。結(jié)果均為陽性，檢出大腸埃希菌。

4 結(jié)果分析與建議

在中藥制劑生產(chǎn)過程中，原料本身是帶菌者，而且生產(chǎn)周期長，處理繁鎖，又增加了染菌的機(jī)會(huì)，中成藥中含糖、淀粉、微量元素等營養(yǎng)成份較多，為微生物生長提供了有利條件。因此藥品的染菌并非偶然，只有在取得相應(yīng)的預(yù)防性措施之后，才能減少或避免污染。

生產(chǎn)單位及生產(chǎn)部門應(yīng)加強(qiáng)對藥品受微生物污染的危害性及控制藥品微生物限度重要性的認(rèn)識和學(xué)習(xí)，切實(shí)改善措施嚴(yán)格控制生產(chǎn)品質(zhì)量；加強(qiáng)原料藥及輔料的合理處理和滅菌，特別是含生藥原粉的制劑更應(yīng)加強(qiáng)處理，美登木生產(chǎn)中就有重樓以生婁入藥，在投原料前應(yīng)進(jìn)行逐項(xiàng)檢查驗(yàn)收，防止蟲蛀、霉變、腐爛原料進(jìn)入生產(chǎn)；滅菌處理應(yīng)根據(jù)藥物有效成份的穩(wěn)定性嚴(yán)格控制溫度及時(shí)間；重視配料容器、用具及包裝材料的處理(消毒或滅菌)，已潔凈的應(yīng)有預(yù)防再污染的方法及措施；提高工作人員的素質(zhì)，加強(qiáng)無菌觀念，工作中嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣；健全質(zhì)量檢驗(yàn)機(jī)制，嚴(yán)格遵守檢驗(yàn)程序，半成品檢驗(yàn)不合格的，決不流到下一工序；成品檢驗(yàn)不合格，決不出廠；改善倉儲條件及運(yùn)輸條件，嚴(yán)防成品的再污染。

R29

A

1007-8517(2014)20-0014-03

2014.09.01)