郭作兵++++孫淑娟

[摘要] 目的 觀察雷米普利對舒張性心力衰竭（DHF）大鼠模型心房肌細胞L型鈣通道的影響。 方法 腹主動脈縮窄術(shù)建立DHF大鼠模型，隨機分為DHF組及雷米普利大、中、小劑量組，另設(shè)對照組。全細胞膜片鉗檢測心房肌細胞L型鈣通道電流（ICa-L）；RT-PCR檢測L型鈣通道上Cav1.2 mRNA的表達；Western blot檢測鈣調(diào)控相關(guān)蛋白LTCC的表達。 結(jié)果 與對照組比較，DHF組大鼠心房肌細胞ICa-L電流密度峰值、Cav1.2 mRNA表達及鈣調(diào)蛋白LTCC的表達明顯降低（P<0.05）；與DHF組比較，雷米普利組心房肌細胞ICa-L電流密度峰值明顯增加、Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)控蛋白LTCC的表達增加（P<0.05），且劑量越大增加越明顯。 結(jié)論 雷米普利能上調(diào)舒張性心力衰竭大鼠心房肌ICa-L電流密度峰值，增加Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)控蛋白LTCC的表達，對DHF大鼠有治療作用，其機制與調(diào)控心房肌細胞L型鈣通道的功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 舒張性心力衰竭；L型鈣通道；雷米普利；Cav1.2

[中圖分類號] R972[文獻標識碼] A[文章編號] 1674-4721（2014）06（b）-0015-04

Influences of ramipril on L-type calcium channel in rats with diastolic heart failure

GUO Zuo-bing1,2 SUN Shu-juan1,3▲

1.School of Pharmaceutical Sciences,Shandong University,Jinan 250012,China;2.Department of Pharmacy,Central Hospital of Qilu Petrochemical Hospital Group,Zibo 255400,China;3.Department of Pharmacy,Shandong Qianfoshan Hospital,Jinan 250014,China

[Abstract] Objective To observe the influence of ramipril on L-type calcium channel in rats with diastolic heart failure (DHF). Methods The rat model of DHF was established by using abdominal aortic coarctation,and then the rats were randomly divided into DHF group,high-dose,mid-dose and low-dose ramipril groups and control group.L-type calcium channel current (ICa-L) was investigated by using a whole cell patchclamp technique.The expression levels of Cav1.2 mRNA were measured by RT-PCR analysis.The expression levels of LTCC were measured by Wsetern blot analysis. Results Compared with control group,the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels of LTCC was lower in DHF group (P<0.05).Compared with the DHF group,the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels ofLTCC increased in three ramipril groups (P<0.05).The more dose of ramipril,the more increasing in ramipril group. Conclusion Ramipril can improve the peak density of atrial ICa-L,the expression levels of Cav1.2 mRNA and the expression levels of LTCC,has the therapeutic effect on DHF in rats,and the mechanism may be related to improving the activties of L-type calcium channel.

[Key words] Diastolic heart failure;L-type calcium channel;Ramipril;Cav1.2

舒張性心力衰竭（diastolic heart failure，DHF）是一組以具有心力衰竭的癥狀和體征，射血分數(shù)正常而舒張功能異常為特征的臨床綜合征[1]。近年來，DHF的發(fā)病率增高，心房肌細胞L型鈣通道功能的異常是其發(fā)生的主要原因之一。研究證實，DHF發(fā)生時常伴有心房顫動，心房顫動對心房肌細胞L型鈣通道電流（ICa-L）有下調(diào)作用[2-3]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）在心房顫動一級預(yù)防和治療中具有重要意義。本研究擬通過觀察雷米普利對DHF大鼠心房肌細胞ICA-L電流密度峰值、與L型鈣通道相關(guān)的Cav1.2 mRNA表達水平、L型鈣通道相關(guān)的鈣調(diào)控蛋白LTCC表達水平的影響，以探討雷米普利對DHF大鼠L型鈣通道的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體重為200～250 g，許可證號：SYXK（魯）2012-2010。

1.1.2 試劑與溶液

HEPES、EGTA和?；撬峋徲赟igma公司，DHPRa1（LTCC）抗體購于Abcam公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，其余的試劑均為國產(chǎn)的分析純。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組

選擇SD雄性大鼠30只，腹主動脈縮窄法制造DHF大鼠模型。模型組大鼠以3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉。固定，剃毛，消毒，開腹腔。暴露左腎上緣腹主動脈，分離腹主動脈，銀夾造成腹主動脈部分狹窄，關(guān)閉腹腔。對照組僅游離腹主動脈但不縮窄，其他操作與手術(shù)組相同。術(shù)后8周，通過超聲心動圖及心導(dǎo)管等方法檢測大鼠心臟舒張功能指標，確立造模成功[4]。將大鼠手術(shù)組隨機分為DHF組，雷米普利大、中、小劑量組。大、中、小劑量組分別給雷米普利1.25、2.50、5.00 mg/（kg·d）灌胃，DHF組和對照組等量生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。

1.2.2 全細胞膜片鉗記錄ICa-L

膠原酶解法分離大鼠心房肌細胞[5-6]。取得適合細胞，放入顯微鏡的細胞池中，貼壁。玻璃電極灌入電極液，電極與細胞表面形成高電阻，完成封接破膜補償快慢電容。MODE置向VC后進行ICa-L記錄。

1.2.3 RT-PCR檢測Cav1.2 mRNA的表達

1.2.3.1 提取RNA剪取大鼠心房組織，稱取75 mg，放入Trizol勻漿，離心，取上清液，氯仿充分混勻，離心20 min，取上清液移，異丙醇沉淀，再離心棄上清，后將RNA用1 ml 75%乙醇洗滌，離心，除乙醇后加0.01%焦碳酸二乙酯，溫浴15 min，后在A260/A280下定量RNA。

1.2.3.2 RT-PCR反應(yīng)混合好RT反應(yīng)及PCR反應(yīng)體系，加水至10 μl混勻，置于PCR儀上，94℃變性5 min，后擴增30個循環(huán)，72℃延伸5 min。凝膠電泳，染色。

1.2.4 Western blot檢測LTCC的表達

提取心房肌細胞膜蛋白，取大鼠左心房組織120 mg，剪碎。后加入裂解液和蛋白酶抑制劑。于勻漿器中打碎，后4℃，離心5 min。取上清液置于EP管，4℃離心。測定膜蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白到PVDF膜上，過夜。脫脂牛奶封閉1 h，1抗孵育及漂洗，2抗孵育及漂洗，加入DAB顯影液顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷米普利對DHF大鼠血流動力學(xué)的影響

與對照組比較，DHF組心率（HR）、左室內(nèi)壓上升下降最大速率（±dp/dt）及左室收縮壓（LVSP）無顯著變化（P>0.05），左室舒張末壓（LVEDP）顯著升高（P<0.05），左室松弛時間常數(shù)（T）顯著延長（P<0.05）。與DHF組比較，雷米普利組HR、±dp/dt、LVSP無明顯變化（P>0.05），LVEDP及T明顯縮短（P<0.05），且中高劑量組較低劑量組變化更明顯（P<0.05）（表1）。

表1 雷米普利對DHF大鼠血流動力學(xué)的影響（x±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DHF組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

2.2 雷米普利對ICa-L的影響

與對照組比較，DHF組大鼠心房肌細胞ICa-L峰值電流密度明顯降低（P<0.05）；與DHF組比較，雷米普利組心房肌細胞ICa-L峰值電流密度顯著上升（P<0.05），且中、高劑量組較低劑量組上升更明顯（P<0.05）（圖1、表2）。

圖1 雷米普利對ICa-L的影響

表2 雷米普利對ICa-L的影響（x±s）

與對照組比較，*P<0.05；與DHF組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

2.3 雷米普利對L型鈣通道上Cav1.2 mRNA表達的影響

與對照組比較，DHF組大鼠心房肌細胞Cav1.2 mRNA表達水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與DHF組比較，雷米普利組大鼠心房肌細胞Cav1.2 mRNA表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且劑量越大增加越明顯（圖2）。

圖2 雷米普利對L型鈣通道上Cav1.2 mRNA表達的影響

2.4 雷米普利對鈣調(diào)控蛋白LTCC表達的影響

與對照組比較，DHF組大鼠心房肌細胞蛋白表達水平較對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；與DHF組比較，雷米普利組大鼠蛋白表達水平明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且劑量越大上升越明顯（圖3）。

圖3 雷米普利對鈣調(diào)控蛋白LTCC表達的影響

3 討論

心房肌細胞的L型鈣通道在電壓依賴性鈣離子通道中占主導(dǎo)作用，是形成慢反應(yīng)及興奮功能的主要成分[9]。Bosch等[10-11]研究認為，DHF常伴有心房顫動的發(fā)生，心房肌細胞ICa-L出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。ICa-L的減少導(dǎo)致動作電位不應(yīng)期（action potential duration，APD）縮短及APD對頻率的適應(yīng)性下降，導(dǎo)致心房顫動的發(fā)生并有利于心房顫動的維持。本研究結(jié)果顯示，DHF組大鼠心房肌細胞ICa-L峰值電流密度下降，提示ICa-L峰值電流密度的下降，可能是L型鈣通道功能改變，導(dǎo)致心房顫動持續(xù)發(fā)生，并且可能是DHF大鼠發(fā)生房性心律失常和電生理重構(gòu)的離子基礎(chǔ)。另本研究中，DHF大鼠的Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)蛋白LTCC的表達顯著降低，提示ICa-L降低可能由基因水平和蛋白表白水平的改變所介導(dǎo)。

雷米普利是ACEI類經(jīng)常使用的藥物之一[12]?，F(xiàn)在研究證實，ACEI可以通過抑制血管緊張素Ⅱ預(yù)防心律失常。在DHF中，腎素血管緊張素系統(tǒng)過度激活和血管緊張素Ⅱ增加，血管緊張素Ⅱ通過激活L型鈣通道，增加攝取細胞外的Ca2+并促進肌漿網(wǎng)Ca2+釋放，使心房肌鈣超載加重[13-14]。雷米普利拮抗血管緊張素Ⅱ的作用是其調(diào)節(jié)DHF心肌ICa-L電重構(gòu)的重要機制。不同劑量雷米普利灌胃處理后，能逆轉(zhuǎn)DHF組大鼠心房肌細胞ICa-L下調(diào)，并上調(diào)Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)蛋白LTCC的表達。雷米普利抑制ICa-L的降低，使鈣通道失活減慢，增加細胞外鈣攝取和肌漿網(wǎng)鈣釋放，從而減輕細胞內(nèi)鈣超載，延長心房APD，抑制心房顫動的發(fā)生。

心房電重構(gòu)分為真假兩種電性重構(gòu)，其中真性重構(gòu)出現(xiàn)在心房顫動開始后的數(shù)小時或數(shù)天。真性重構(gòu)中，離子通道蛋白基因表達改變，隨之出現(xiàn)持續(xù)時間甚久的通道蛋白數(shù)量及功能變化[15-16]。本實驗中，雷米普利上調(diào)了Cav1.2 mRNA及鈣調(diào)蛋白LTCC的表達水平，顯示雷米普利對L型鈣通道的作用與基因水平和蛋白水平的改變都有關(guān)。因此，雷米普利通過對L型鈣通道的影響，抑制心房肌細胞的真性電重構(gòu)，對防治心房顫動有重要而持久的作用。

[參考文獻]

[1]Giamouzis G，Giannakoulas G，Butler J，et al.Heart failure 2012[J].Cardiol Res Pract，2012，2012：126324.

[2]Tsang TS，Gersh BJ，Appleton CP，et al.Left ventricular diastolic dysfunction as a predictor of the first diagnosed nonvalvular atrial fibrillation in 840 elderly men and women[J].J Am Coll Cardiol，2002，40（9）：636-644.

[3]Rose RA，Sellan M，Simpson JA，et al.Iron overload decreases CaV1.3-dependent L-type Ca2+ currents leading to bradycardia，altered electrical conduction，and atrial fibrillation[J].Circ Arrhythm Electrophysiol，2011， 4（5）：733-742.

[4]蔡毅.壓力負荷誘導(dǎo)的舒張性心力衰竭動物模型建立與倍他樂克干預(yù)治療[D].北京：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院，2007.

[5]Ohmoto-Sekine Y，Uemura H，Tamagawa M，et al.Inhibitory effects of aprindine on the delayed rectifier K+ current and the muscarinic acetylcholine receptor-operated K+ current in guinea-pig atrial cells[J].Br J Pharmacol，1999， 126（3）：751-761.

[6]Nakaya H，Tohse N，Takeda Y，et al.Effects of MS-551，a new class Ⅲ antiarrhythmic drug，on action potential and membrane currents in rabbit ventricular myocytes[J].Br J Pharmaco，1993，109（1）：157-163.

[7]胡詠梅，李法琦，羅羽惠，等.腹主動脈縮窄大鼠模型制作及臨床意義[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，29（3）：322-324.

[8]朱丹，郭艷紅，于海奕，等.兩種早期心衰大鼠模型的建立和心功能的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（9）：20-24.

[9]孫宇，胡慧媛，郝麗英，等.心肌L型鈣通道鈣依賴性調(diào)節(jié)研究新進展[J].生理科學(xué)進展，44（5）：372-376.

[10]Bosch RF，Scherer CR，Rub N，et al.Molecular mechanisms of early electrical remodeling：transcriptional downregulation of ion channel subunits reduces I（Ca，L）and I（to） in rapid atrial pacing in rabbits[J].J Am Coll Cardiol，2003，41（5）：858-869.

[11]Van Wagoner DR，Pond AL，Lamorgese M，et al.Atrial L-type Ca2+ currentsand human atrial fibrillation[J].Circ Res，1999，85（5）：428-436.

[12]周力，王翠英，陳暉，等.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑在心房顫動一級預(yù)防中的可能作用[J].中華老年心腦血管病雜志，2010，12（12）：1149-1150.

[13]Tesfamariam B，F(xiàn)rohlich BH，Gregg RE.Differential effects of pravastatin，simvastatin，and atorvastatin on Ca2+ release and vascular reactivity[J].J Cardiovasc Pharmacol，1999，34（1）：95-101.

[14]Liu Z，Vogel HJ.Structural basis for the regulation of L-type voltage-gated calcium channels：interactions between the N-terminal cytoplasmic domain and Ca2+-calmodulin[J].Front Mol Neurosci，2012，5：38.

[15]Pandozi C，Santini M.Update on atrial remodeling owing to rate；does atrial fibrillation always beget atrial fibrillation?[J].Eur Heart J，2001，22（7）：541-553.

[16]Nattel S.Atrial electrophysiological remodeling caused by rapid atrial activation：underlying mechanisms and clinical relevance to atrial fibrillation[J].Cardiovasc Res，1999， 42（2）：298-308.

（收稿日期：2014-03-05本文編輯：郭靜娟）

[4]蔡毅.壓力負荷誘導(dǎo)的舒張性心力衰竭動物模型建立與倍他樂克干預(yù)治療[D].北京：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院，2007.

[5]Ohmoto-Sekine Y，Uemura H，Tamagawa M，et al.Inhibitory effects of aprindine on the delayed rectifier K+ current and the muscarinic acetylcholine receptor-operated K+ current in guinea-pig atrial cells[J].Br J Pharmacol，1999， 126（3）：751-761.

[6]Nakaya H，Tohse N，Takeda Y，et al.Effects of MS-551，a new class Ⅲ antiarrhythmic drug，on action potential and membrane currents in rabbit ventricular myocytes[J].Br J Pharmaco，1993，109（1）：157-163.

[7]胡詠梅，李法琦，羅羽惠，等.腹主動脈縮窄大鼠模型制作及臨床意義[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，29（3）：322-324.

[8]朱丹，郭艷紅，于海奕，等.兩種早期心衰大鼠模型的建立和心功能的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（9）：20-24.

[9]孫宇，胡慧媛，郝麗英，等.心肌L型鈣通道鈣依賴性調(diào)節(jié)研究新進展[J].生理科學(xué)進展，44（5）：372-376.

[10]Bosch RF，Scherer CR，Rub N，et al.Molecular mechanisms of early electrical remodeling：transcriptional downregulation of ion channel subunits reduces I（Ca，L）and I（to） in rapid atrial pacing in rabbits[J].J Am Coll Cardiol，2003，41（5）：858-869.

[11]Van Wagoner DR，Pond AL，Lamorgese M，et al.Atrial L-type Ca2+ currentsand human atrial fibrillation[J].Circ Res，1999，85（5）：428-436.

[12]周力，王翠英，陳暉，等.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑在心房顫動一級預(yù)防中的可能作用[J].中華老年心腦血管病雜志，2010，12（12）：1149-1150.

[13]Tesfamariam B，F(xiàn)rohlich BH，Gregg RE.Differential effects of pravastatin，simvastatin，and atorvastatin on Ca2+ release and vascular reactivity[J].J Cardiovasc Pharmacol，1999，34（1）：95-101.

[14]Liu Z，Vogel HJ.Structural basis for the regulation of L-type voltage-gated calcium channels：interactions between the N-terminal cytoplasmic domain and Ca2+-calmodulin[J].Front Mol Neurosci，2012，5：38.

[15]Pandozi C，Santini M.Update on atrial remodeling owing to rate；does atrial fibrillation always beget atrial fibrillation?[J].Eur Heart J，2001，22（7）：541-553.

[16]Nattel S.Atrial electrophysiological remodeling caused by rapid atrial activation：underlying mechanisms and clinical relevance to atrial fibrillation[J].Cardiovasc Res，1999， 42（2）：298-308.

（收稿日期：2014-03-05本文編輯：郭靜娟）

[4]蔡毅.壓力負荷誘導(dǎo)的舒張性心力衰竭動物模型建立與倍他樂克干預(yù)治療[D].北京：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院，2007.

[5]Ohmoto-Sekine Y，Uemura H，Tamagawa M，et al.Inhibitory effects of aprindine on the delayed rectifier K+ current and the muscarinic acetylcholine receptor-operated K+ current in guinea-pig atrial cells[J].Br J Pharmacol，1999， 126（3）：751-761.

[6]Nakaya H，Tohse N，Takeda Y，et al.Effects of MS-551，a new class Ⅲ antiarrhythmic drug，on action potential and membrane currents in rabbit ventricular myocytes[J].Br J Pharmaco，1993，109（1）：157-163.

[7]胡詠梅，李法琦，羅羽惠，等.腹主動脈縮窄大鼠模型制作及臨床意義[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，29（3）：322-324.

[8]朱丹，郭艷紅，于海奕，等.兩種早期心衰大鼠模型的建立和心功能的比較[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（9）：20-24.

[9]孫宇，胡慧媛，郝麗英，等.心肌L型鈣通道鈣依賴性調(diào)節(jié)研究新進展[J].生理科學(xué)進展，44（5）：372-376.

[10]Bosch RF，Scherer CR，Rub N，et al.Molecular mechanisms of early electrical remodeling：transcriptional downregulation of ion channel subunits reduces I（Ca，L）and I（to） in rapid atrial pacing in rabbits[J].J Am Coll Cardiol，2003，41（5）：858-869.

[11]Van Wagoner DR，Pond AL，Lamorgese M，et al.Atrial L-type Ca2+ currentsand human atrial fibrillation[J].Circ Res，1999，85（5）：428-436.

[12]周力，王翠英，陳暉，等.血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑在心房顫動一級預(yù)防中的可能作用[J].中華老年心腦血管病雜志，2010，12（12）：1149-1150.

[13]Tesfamariam B，F(xiàn)rohlich BH，Gregg RE.Differential effects of pravastatin，simvastatin，and atorvastatin on Ca2+ release and vascular reactivity[J].J Cardiovasc Pharmacol，1999，34（1）：95-101.

[14]Liu Z，Vogel HJ.Structural basis for the regulation of L-type voltage-gated calcium channels：interactions between the N-terminal cytoplasmic domain and Ca2+-calmodulin[J].Front Mol Neurosci，2012，5：38.

[15]Pandozi C，Santini M.Update on atrial remodeling owing to rate；does atrial fibrillation always beget atrial fibrillation?[J].Eur Heart J，2001，22（7）：541-553.

[16]Nattel S.Atrial electrophysiological remodeling caused by rapid atrial activation：underlying mechanisms and clinical relevance to atrial fibrillation[J].Cardiovasc Res，1999， 42（2）：298-308.

（收稿日期：2014-03-05本文編輯：郭靜娟）