賀軍++++++文武++++++陳國(guó)棟++++++丁成明++++++黃秋林++++++賀更生

[摘要] 目的 運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)miR-331-3p在肝癌細(xì)胞株和肝癌組織中的表達(dá)，探討其在肝癌中表達(dá)的臨床意義及潛在臨床價(jià)值。 方法 采用基于2-ΔΔCt的qRT-PCR檢測(cè)miR-331-3p在正常肝細(xì)胞株（HL-7702）、不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的肝癌細(xì)胞株（HepG2、MHCC97-H、HCCLM3）的表達(dá)，同時(shí)收集5例正常肝組織、30例肝癌組織及癌旁組織，進(jìn)行定量分析，并分析miR-331-3p與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 與正常肝細(xì)胞株相比，miR-331-3p在肝癌細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，且隨著肝癌細(xì)胞株侵襲轉(zhuǎn)移程度增加，其表達(dá)下調(diào)越明顯（P<0.05）；與正常肝組織相比，肝癌組織中miR-331-3p有不同程度的表達(dá)下調(diào)（P<0.05），且與肝癌患者腫瘤多發(fā)結(jié)節(jié)（P=0.036）、低分化程度（P=0.035）以及伴有靜脈浸潤(rùn)（P=0.016）等臨床病理特征相關(guān)。 結(jié)論 miR-331-3p在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程可能發(fā)揮重要作用，miR-331-3p有望成為肝癌新的生物標(biāo)志物或預(yù)后因子。

[關(guān)鍵詞] miRNA；miR-331-3p；肝細(xì)胞癌；臨床病理特征

[中圖分類號(hào)] R735.7[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A[文章編號(hào)] 1674-4721（2014）06（b）-0004-04

Study on the expression of miR-331-3p in hepatocellular carcinoma

HE Jun WEN Wu* CHEN Guo-dong DING Cheng-ming HUANG Qiu-lin HE Geng-sheng▲

Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital of University of South China,Hengyang 421001,China

[Abstract] Objective To detect the expression of miR-331-3p in hepatocellular carcinoma (HCC) by quantificational real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and investigate the significance and potential clinical value of miR-331-3p in HCC. Methods 2-ΔΔCt method was used for qRT-PCR of the expression pattern of miR-331-3p in normal human liver cell line HL-7702 and different invasion and metastasis of HCC cell lines (HepG2,MHCC97-H,HCCLM3),meanwhile,5 normal liver tissues,30 HCC and adjacent tissues were selected,and the relationship between the expression of miR-331-3p and the clinicopathological characteristics of HCC was analyzed. Results Compared with normal liver cell line,hepatocellular carcinoma cell lines showed miR-331-3p down-regulation,and with the increase of the degree of invasion and metastasis,the more obvious its down-regulation (P<0.05).Compared with normal liver tissues,the HCC tissues showed significant miR-331-3p down-regulation (P<0.05),and it was related to multiple tumor nodules (P=0.036),low differentiation (P=0.035),and venous invasion (P=0.016). Conclusion In the process of the occurrence and development of HCC,miR-331-3p may play an important role,it is expected to become the new biomarker or prognostic factor of HCC.

[Key words] miRNA;miR-331-3p;Hepatocellular carcinoma;Clinical pathological features

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種病死率高、生存期短的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在全球HCC每年新增病例國(guó)家中，中國(guó)排在第1位，占全球總發(fā)病率的50%，西方國(guó)家發(fā)病率雖不高但卻在逐年遞增[1]，對(duì)于有機(jī)會(huì)行手術(shù)切除的HCC患者，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍可高達(dá)50%～70%[2]。

miRNA是一類由長(zhǎng)度為18~25個(gè)核苷酸（nt）組成的單鏈非編碼小RNA分子，其在真核生物中廣泛存在，具有高度遺傳穩(wěn)定性。初始的miRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在核糖核酸酶Drosha和Dicer1進(jìn)行剪接，從而發(fā)展成為成熟的miRNA[3]，后者實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控的作用機(jī)制主要通過與靶基因mRNA的3′UTR結(jié)合而使mRNA降解或抑制其翻譯，由此miRNA可以通過癌基因和抑癌基因的相互作用對(duì)腫瘤的發(fā)生、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移進(jìn)行調(diào)控，從而影響腫瘤患者的預(yù)后。某些miRNA在腫瘤組織表達(dá)具有特異性，且在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了非常重要的調(diào)控作用[4-5]。miR-331-3p作為miRNA家族中一員，目前在腫瘤的相關(guān)研究中miR-331-3p的研究相對(duì)較少，少量研究結(jié)果顯示miR-331-3p在胃癌[6]、前列腺癌[7]、白血病[8]等惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。然而miR-331-3p在HCC中的相關(guān)研究較少，因此本研究初步探討miR-331-3p在HCC中的表達(dá)情況，以期為miRNA在HCC中發(fā)揮的作用提供新的依據(jù)，同時(shí)為HCC的生物學(xué)診斷和治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自北京康為公司。miR-331-3p及RNA U6引物由廣州銳博生物公司合成。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自promega公司，SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自TAKARA公司。氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。Nanodrop2000/2000C分光光度計(jì)（Thermo公司）和穩(wěn)壓電泳儀（上海天能）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-7702細(xì)胞、MHCC97-H細(xì)胞及HCCLM3細(xì)胞來源于中科院上海細(xì)胞研究所，HepG2細(xì)胞由南華大學(xué)心血管疾病研究所實(shí)驗(yàn)室提供。用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于含5%CO2、37℃、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本來源

選取2011年11月～2013年7月在南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科、腫瘤外科及湘雅二醫(yī)院普外科行手術(shù)切除術(shù)的HCC組織標(biāo)本共30例，男性24例，女性6例，年齡32～81歲，中位年齡56歲。HCC組織：取自實(shí)性癌中未壞死的區(qū)域。癌旁組織：距離癌灶邊緣2 cm的組織。選取肝血管瘤及肝外傷行肝切除患者的正常肝臟組織5例。所有病例術(shù)前均未放化療，組織性質(zhì)均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。手術(shù)切除的組織標(biāo)本離體后迅速置入液氮冷凍，之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。收集HCC患者的一般信息及臨床病理資料，如性別、年齡、有無肝硬化、術(shù)前血清甲胎蛋白（AFP）值、腫瘤直徑、腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、有無包膜、腫瘤分化程度以及有無靜脈浸潤(rùn)等，并根據(jù)以上臨床病理特征進(jìn)行逐一分組。

1.4 總RNA提取

按照TRIzol試劑（Invitrogen公司）操作說明書的步驟，分別提取出細(xì)胞及組織標(biāo)本的總RNA，紫外分光光度計(jì)評(píng)估 RNA的濃度和純度。所有RNA樣品置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 逆轉(zhuǎn)錄

RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA（根據(jù)Promega公司M-MLV操作說明書進(jìn)行），RT反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 60 min，70℃ 10 min。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置冰上冷卻，置-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6 qPCR檢測(cè)

根據(jù)TAKARA公司SYBR Master Mixture操作說明書進(jìn)行，且每個(gè)樣本重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件95℃ 10 min，之后95℃ 30 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)（引物序列見表1）。擴(kuò)增反應(yīng)在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀TP800（TAKARA公司）上進(jìn)行。miR-331-3p的相對(duì)定量以RNA U6為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算公式為2-ΔΔCt。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料為正態(tài)分布的，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩個(gè)獨(dú)立樣本組間表達(dá)差異使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，采用GraphPad Prism 5.0軟件繪制直方圖。

2 結(jié)果

2.1 RNA濃度測(cè)定

細(xì)胞及組織樣品A260/A280在1.8～2.0之間，RNA純度較高，無DNA、蛋白質(zhì)等污染。

2.2 miR-331-3p在正常肝細(xì)胞株及肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)

miR-331-3p在3株不同侵襲轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97-H、HepG2中的表達(dá)量分別為0.303±0.029、0.377±0.036、1.001±0.049，顯著低于在正常肝細(xì)胞株HL-7702中的表達(dá)量1.698±0.047，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨著肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移程度的增加，其表達(dá)下調(diào)越明顯（圖1）。

圖1 各細(xì)胞株miR-331-3p的相對(duì)表達(dá)水平

與MHCC97-H細(xì)胞株比較，*P<0.05；與HepG2細(xì)胞株比較，#P<0.05；與HL-7702細(xì)胞株比較，△P<0.05

2.3 miR-331-3p在正常肝組織、癌旁組織、肝癌組織中的表達(dá)

miR-331-3p在肝癌組織的表達(dá)為0.792±0.188，顯著低于正常組織及癌旁組織（8.325±0635、1.696±0.532），各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

圖2各標(biāo)本miR-331-3p的相對(duì)表達(dá)水平

與癌旁組織比較，*P<0.05；與正常肝組織比較，#P<0.05

2.4 miR-331-3p與肝癌患者臨床病理的相關(guān)性

miR-331-3p在腫瘤多發(fā)結(jié)節(jié)、低分化以及伴有靜脈浸潤(rùn)的肝癌患者組織樣本中的表達(dá)明顯低于單個(gè)結(jié)節(jié)（P=0.036）、高-中分化（P=0.035）、無靜脈浸潤(rùn)（P=0.016）的肝癌組織。miR-331-3p表達(dá)與患者的性別、年齡、AFP值、有無肝硬化、腫瘤直徑以及有無包膜無明顯相關(guān)性（P>0.05）（表2）。

3 討論

肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其多在肝硬化的基礎(chǔ)上形成[9]，已知危險(xiǎn)因素還包括HBV和HCV感染、黃曲霉毒素B1、慢性酒精性肝病以及營(yíng)養(yǎng)不良等眾多原因[10]。這些危險(xiǎn)因素，影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的非編碼調(diào)控小RNA分子，它的主要生物學(xué)功能是對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)進(jìn)程[11]。大量的證據(jù)表明，miRNA的異常表達(dá)與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其可能作為一種新型的分子靶標(biāo)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮類似癌基因和抑癌基因的作用[12-15]。

miRNA可作為一種癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)。Song等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-21的細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比顯著增加，而轉(zhuǎn)染抗miR-21的細(xì)胞則顯著降低。Segura等[17]發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-182有促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞在體內(nèi)外轉(zhuǎn)移的潛能，而下調(diào)miR-182則可防止細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。miRNA也可作為一種抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)。有研究表明[18]，let-7通過作用于MHY9基因抑制胃癌細(xì)胞在試管內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移。Wiggins等[19]發(fā)現(xiàn)miR-34a能抑制缺乏p53功能的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移。

miR-331-3p作為miRNA家族中一員，在多個(gè)腫瘤及生理過程中均發(fā)揮重要作用。Wang等[20]通過對(duì)90個(gè)永生化淋巴母細(xì)胞系366種miRNAs和14174mRNAs之間關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p與細(xì)胞周期相關(guān)。Hosako等[21]在p53缺失的小鼠中發(fā)現(xiàn)miR-331-3p的表達(dá)有明顯的改變，p53的缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎中的顱腦畸形，這種胚胎形態(tài)學(xué)的改變可能與miR-331-3p的異常表達(dá)有關(guān)。De Martino等[22]研究發(fā)現(xiàn)miR-331-3p在缺失了HMGA1蛋白的鼠胚胎成纖維細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，miR-331-3p受HMGA1調(diào)控，預(yù)示miR-331-3p參與了HMGA1所調(diào)控的生物途徑并發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。

本文體外研究結(jié)果顯示，肝癌細(xì)胞株中miR-331-3p的表達(dá)顯著低于正常肝細(xì)胞株，且隨著肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移程度的增加，其表達(dá)下調(diào)越明顯。同時(shí)，臨床肝癌組織標(biāo)本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-331-3p在肝癌組織的表達(dá)明顯低于正常肝組織及癌旁組織，提示miR-331-3p表達(dá)下調(diào)參與了肝癌的發(fā)生，miR-331-3p在肝癌發(fā)生中可能起著負(fù)調(diào)控的作用。進(jìn)一步分析肝癌中miR-331-3p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，其與肝癌患者腫瘤多發(fā)結(jié)節(jié)、低分化程度以及伴有靜脈浸潤(rùn)等臨床病理特征相關(guān)，提示miR-331-3p低表達(dá)可能促進(jìn)了肝癌細(xì)胞侵襲性的生物學(xué)行為。而miR-331-3p表達(dá)與性別、年齡、AFP值、有無肝硬化、腫瘤直徑以及有無包膜均無明顯相關(guān)性。

在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中miR-331-3p如何發(fā)揮生物學(xué)作用，其具體機(jī)制是什么，這些還有待于后續(xù)研究。開展對(duì)miR-331-3p的功能學(xué)研究，有望進(jìn)一步闡明肝癌的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)有望為肝癌的生物學(xué)診斷、個(gè)體化治療、預(yù)后判斷提供重要的理論依據(jù)和新的分子靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2014-03-12本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期：2014-03-12本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期：2014-03-12本文編輯：郭靜娟）