楊 超， 康 煒， 李建華， 尤 濤， 王永鋒

(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710077)

1996 年，Watson等[1]發(fā)現(xiàn)了人乳腺珠蛋白(human mammaglobin，hMAM)基因，并初步證明該基因是乳腺癌(或乳腺)細(xì)胞特異性表達(dá)基因。自hMAM發(fā)現(xiàn)以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用各種方法，如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)、免疫組化等檢測(cè)乳腺或乳腺癌組織以及外周血中hMAM基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)hMAM基因在乳腺癌診治過程中具有重要作用[2-5]。但這些檢測(cè)方法均存在一定局限性，如RT-PCR生成的mRNA容易降解[6-7]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)外周血中hMAM基因所編碼的蛋白含量則相對(duì)比較穩(wěn)定[8-11]，且國(guó)內(nèi)、外關(guān)于檢測(cè)血清hMAM蛋白的研究報(bào)道甚少。為此，我們采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)了乳腺癌患者血清 hMAM水平，探討hMAM與乳腺癌早期診斷以及癌微轉(zhuǎn)移早期發(fā)現(xiàn)的相關(guān)性。

材料和方法

一、對(duì)象

收集西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2008年6月至2011年12月住院和門診篩查患者107例，其中乳腺癌患者68例(包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌56例、混合型浸潤(rùn)性導(dǎo)管小葉癌5例、浸潤(rùn)性小葉癌3例、黏液腺癌4例)，男1例，女67例，年齡36～65歲;良性乳腺疾病患者35例(乳腺增生20例、纖維腺瘤12例、纖維性乳腺囊性病3例)，男3例，女32例，年齡35～65歲;其他癌癥患者40例(前列腺癌、胃癌、卵巢癌、直腸癌各10例)，男18例，女22例，年齡35～70歲。所有患者均有明確的病理診斷和臨床分期。68例乳腺癌患者按臨床TNM分期分為Ⅰ期(20例)、Ⅱ期(20例)、Ⅲ期(20例)、Ⅳ期(8例);按是否存在雌激素受體(estrogen receptor，ER)表達(dá)分為 ER(+)(48例)、ER(－)(20例);按是否絕經(jīng)分為絕經(jīng)前(36例)、絕經(jīng)后(32例);按是否有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為有轉(zhuǎn)移(48例)、無轉(zhuǎn)移(20例)。以同期西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院健康體檢正常女性40名作為正常對(duì)照組，年齡35～65歲。

二、試劑和儀器

hMAM ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司;安圖斯洗板機(jī)和安圖斯2010型酶標(biāo)儀購(gòu)自匈牙利Anthos公司。

三、方法

1.標(biāo)本采集 所有對(duì)象均于清晨空腹抽取靜脈血3 mL，室溫靜置20 min后2500×g離心5 min獲取血清，－70℃保存待測(cè)。癌癥患者和乳腺良性腫塊患者于術(shù)前1 d抽取血液標(biāo)本。

2.血清hMAM檢測(cè) 加40 μL樣品稀釋液至各酶標(biāo)包被板的樣品孔內(nèi)，再加血清10 μL;封板膜封板，放入37℃溫育箱溫育30 min;揭開封板膜，棄除液體，洗板機(jī)洗板5次，拍干后每孔加酶標(biāo)試劑50 μL，用封板膜封板后 37℃溫育30 min;揭開封板膜，棄除液體，重復(fù)洗板5次后，拍干后每孔加顯色劑A、B各50 μL，37℃避光顯色15 min，再加終止液50 μL。以空白為對(duì)照，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度(A)值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用受試者工作特征(ROC)曲線確定血清hMAM診斷乳腺癌的Cut-off值，計(jì)算ROC曲線下面積、敏感性和特異性。組間血清hMAM水平比較采用t檢驗(yàn)，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ROC曲線對(duì)血清hMAM水平的評(píng)價(jià)

根據(jù)68例乳腺癌和75例非乳腺癌(35例良性乳腺疾病、40名正常對(duì)照者)血清hMAM水平繪制ROC曲線，其ROC曲線下面積為0.825，即診斷乳腺癌的可信度為82.5%[95%可信區(qū)間(CI):72.6% ～92.4%]。乳腺癌患者血清hMAM 的Cut-off值為8.43 ng/mL，此時(shí)hMAM 篩查乳腺癌的敏感性和特異性分別為76.5%、82.9%，見圖1。本研究以血清hMAM ＞8.43 ng/mL作為陽性結(jié)果。

二、各組血清hMAM水平及陽性率比較

乳腺癌患者血清hMAM水平及陽性率明顯高于良性乳腺疾病組、其他癌癥組和正常對(duì)照組(P＜0.05)，而良性乳腺疾病組、其他癌癥組和正常對(duì)照組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

圖1 乳腺癌患者血清hMAM的ROC曲線圖

表1 各組血清hMAM水平及陽性率比較

三、乳腺癌不同分組的血清hMAM水平及陽性率比較

Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者的血清hMAM陽性率(55%、75%)明顯高于Ⅰ、Ⅱ期患者(25%、40%，P＜0.05)，有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血清hMAM陽性率(88%)明顯高于無轉(zhuǎn)移的患者(30%，P＜0.05)，但hMAM水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。不管乳腺癌患者血清中是否存在ER、原癌基因C-erb-2表達(dá)及是否絕經(jīng)，其血清hMAM水平及陽性率均無差異(P＞0.05)。見表2。

四、不同hMAM水平區(qū)間各組人數(shù)比例統(tǒng)計(jì)

乳腺癌組、乳腺良性疾病組及正常對(duì)照組血清hMAM水平在8.0 ng/mL左右及之前有部分重疊，但從9.0 ng/mL之后乳腺癌組人數(shù)明顯高于其他2組;而良性乳腺疾病組和正常對(duì)照組血清hMAM水平人數(shù)大致相同。見圖2。

表2 乳腺癌不同分組的血清hMAM陽性率比較

圖2 不同hMAM水平區(qū)間各組人數(shù)比例統(tǒng)計(jì)

討 論

乳腺癌是女性群體中最常見的惡性腫瘤，也是當(dāng)今世界女性重要的公共健康問題。在乳腺癌早期(轉(zhuǎn)移前或轉(zhuǎn)移初期)能夠得到及時(shí)診治，對(duì)于改善預(yù)后和降低死亡率至關(guān)重要[12]。當(dāng)前，有一些敏感性較高的方法被用來癌癥篩查，特別是利用患者外周血檢測(cè)癌細(xì)胞和腫瘤標(biāo)志物，這些方法涉及到的生物學(xué)技術(shù)包括流式細(xì)胞術(shù)、RTPCR、免疫組化、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QPCR)、ELISA 等[7-8，10]。

hMAM基因是第1個(gè)應(yīng)用差異篩選分離到的新的乳腺癌相關(guān)基因，定位于11q13，編碼1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為10000的糖蛋白，與1個(gè)上皮分泌蛋白家族中的 hCC10蛋白、rUg、rPSC3具有同源性。hMAM基因能在部分乳腺腫瘤中擴(kuò)增出。Watson等[1]認(rèn)為hMAM基因具有組織特異性，只在乳腺中表達(dá)。這使hMAM基因有可能成為有助于乳腺癌診斷的腫瘤標(biāo)志物。Berustein等[10]和Zehentner等[11]研究發(fā)現(xiàn)hMAM基因表達(dá)具有乳腺特異性，可以作為一種乳腺癌標(biāo)志物用于乳腺癌的診斷和微轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)。

癌轉(zhuǎn)移是致使乳腺癌患者死亡的首要原因。但目前即使高分辨率的成像技術(shù)也不能檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)移[13]。流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR、ELISA等具有較高敏感性的檢測(cè)方法可以用來篩查外周血中擴(kuò)散的癌細(xì)胞以及癌基因的表達(dá)。利用RT-PCR檢測(cè)血清中hMAM mRNA表達(dá)以篩查乳腺癌微轉(zhuǎn)移比較常見，但該方法也有一定的缺陷:mRNA易降解，致使血液標(biāo)本不能長(zhǎng)時(shí)間保存，而在短時(shí)間內(nèi)又不能得到大量的乳腺癌患者血液標(biāo)本用于較大規(guī)模的檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)及分析。Berustein等[10]認(rèn)為血清中的hMAM蛋白在反復(fù)冷凍、溶解的條件下亦可長(zhǎng)時(shí)間的保存。本研究利用ELISA檢測(cè)血清中hMAM蛋白水平的變化，其方法步驟雖復(fù)雜、繁瑣，注意事項(xiàng)也頗多，但研究中涉及的主要環(huán)節(jié)均嚴(yán)格按照規(guī)定的方法制備試劑并進(jìn)行測(cè)定，力求各個(gè)步驟操作標(biāo)準(zhǔn)化，如加樣準(zhǔn)確、保溫處理、洗滌徹底和比色等。在此基礎(chǔ)上，由于ELISA中酶的高催化性產(chǎn)生的高反應(yīng)性使測(cè)定方法達(dá)到很高敏感度的優(yōu)點(diǎn)得到充分發(fā)揮。因此，對(duì)檢測(cè)乳腺癌患者血清中hMAM蛋白具有較高的可信性。本研究結(jié)果顯示血清hMAM對(duì)乳腺癌的診斷可信度較高，達(dá)82.5%;當(dāng)Cutoff值為8.43 ng/mL時(shí)其敏感性和特異性分別為76.5%、82.9%。乳腺癌患者血清hMAM水平及陽性率明顯高于良性乳腺疾病患者、其他癌癥患者及正常對(duì)照者(P＜0.05)。乳腺癌患者血清hMAM陽性率與其臨床分期和是否有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，而與ER、原癌基因C-erb-2表達(dá)及是否絕經(jīng)無關(guān)(P＞0.05)。血清hMAM＞9.0 ng/mL的乳腺癌組人數(shù)明顯多于乳腺良性疾病組和正常對(duì)照組。以上結(jié)果說明hMAM與乳腺癌具有相關(guān)性，能用于乳腺癌的早期診斷。本研究結(jié)果顯示不管乳腺癌患者臨床TNM分期、ER是否表達(dá)、是否絕經(jīng)、是否有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其血清hMAM水平均無差異(P＞0.05)。究其原因可能與hMAM在乳腺癌中出現(xiàn)高表達(dá)，即高特異性有關(guān)[10-11]。

綜上所述，hMAM有可能成為一種較為理想的診斷早期乳腺癌的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)乳腺癌的早期診斷及微轉(zhuǎn)移的早期發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。隨著研究技術(shù)的進(jìn)步和人類對(duì)腫瘤的深刻認(rèn)識(shí)，相信hMAM會(huì)很快地被列為臨床常用的腫瘤檢測(cè)指標(biāo)，更好地指導(dǎo)臨床醫(yī)生對(duì)乳腺癌疾病的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療。

[1]Waston MA，F(xiàn)leming TP.Mammaglobin a mammaryspecific member of the uteroglobin gene family，is overexpressed in human breast cancer[J].Cancer Res，1996，56(4):860-865.

[2]Li G，Zhang J，Jin K，et al.Human mammaglobin:a superior marker for reverse-transcriptase PCR in detecting circulating tumor cells in breast cancer patients[J].Biomark Med，2011，5(2):249-260.

[3]呂曉娟，黃 焰，張賀秋，等.乳腺珠蛋白在乳腺癌、良性病變及正常乳腺組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].軍事醫(yī)學(xué)，2012，36(2):137-140.

[4]Rehman F，Nagi AH，Hussain M.Immunohistochemical expression and correlation of mammaglobin with the grading system of breast carcinoma[J].Indian J Pathol Microbiol，2010，53(4):619-623.

[5]呂賽平，鄒學(xué)森.人乳腺珠蛋白檢測(cè)在乳腺癌診斷中的臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].實(shí)用癌癥雜志，2010，25(3):321-322.

[6]顧 敏，吳 敏，黨勝春.乳腺癌患者外周血hMAM mRNA的表達(dá)與 C-erbB-2、ER、PR及 p53的相關(guān)性[J].山東醫(yī)藥，2009，49(44):48-49.

[7]Span PN，Van Laarhoven HW，Sweep FC.Mammaglobin RT-qPCR for breast cancer metastasis detection in sentinel lymph nodes[J].Cancer Sci，2010，101(11):2501.

[8]周 偉，黃 焰.乳腺珠蛋白研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊，2011，22(4):572-574.

[9]Fanger GR，Houghton RL，Retter MW，et al.Detection of mammaglobin in the sera of patients with breast cancer[J].Tumour Biol，2002，23(4):212-221.

[10]Berustein JL，Godbold JH，Raptis G，et al.Identification of mammaglobin as a novel serum marker for breast cancer[J].Clin Cancer Res，2005，11(18):6528-6535.

[11]Zehentner BK，Carter D.Mammaglobin:a candidate diagnostic marker for breast cancer[J].Clin Biochem，2004，37(4):249-257.

[12]Smith RA，Cokkinides V，Eyre HJ，et al.American cancer society guidelines for the early detection of cancer，2003[J].CA Cancer J Clin，2003，53(1):27-43.

[13]Van der Auwera I，Peeters D，Benoy IH，et al.Circulating tumour cell detection:a direct comparison between the cell search system，the Adna Test and CK-19/mammaglobin RT-PCR in patients with metastatic breast cancer[J].Br J Cancer，2010，102(2):276-284.