馬曉萍，高曉勤，楊燕平，楊 喆

(1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州 遵義 563002;2.貴陽醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

精漿中性 α-1，4-糖苷酶(alpha-1，4 glycosidase，α-1，4-G)來源于附睪，由附睪上皮分泌，是附睪功能的特異性酶及標(biāo)志酶[1]。常規(guī)精液分析(routine semen analysis，RSA)一直是評價(jià)男性生育力的主要實(shí)驗(yàn)室手段，但僅依靠其結(jié)果來預(yù)測男性生育狀況是不全面的。精漿中性α-1，4-G可間接反映附睪的功能及對精子各種參數(shù)的影響。精子透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HYD)是一種重要的存在于精子頂體的酶，是受精過程中的關(guān)鍵酶之一。我們分析了不育患者精漿中性α-1，4-G活性與RSA參數(shù)、HYD活性(HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度)的關(guān)系，以探討其間的相關(guān)性。

材料和方法

一、對象

正常生育組12名，均為有生育能力的男性自愿獻(xiàn)精者，年齡24～40歲。不育組52例，選自貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖檢驗(yàn)中心就診患者，年齡24～40歲，均為婚后正常性生活2年以上不育(排除女方不育原因)，無外傷及遺傳性疾病家族史，無性功能障礙病史，體檢未發(fā)現(xiàn)有明顯睪丸、附睪及輸精管異常。精漿中性α-1，4-G活性參考區(qū)間按文獻(xiàn)[2]界定。根據(jù)精漿中性α-1，4-G活性檢測結(jié)果將不育患者分為中性α-1，4-G活性正常組(簡稱酶活性正常組)與中性α-1，4-G活性異常組(簡稱酶活性異常組)。

二、主要儀器及試劑

Anke-GL-16 G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭儀器廠)，SPX-150C型恒溫恒濕箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，Sartorius BS2103型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，偉力WLJY9000彩色精子質(zhì)量檢測系統(tǒng)(北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司)，Mias攝影圖象分析系統(tǒng)(上海天程科技有限公司)，精漿中性α-1，4-G定量檢測試劑盒(酶法，深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)。

三、方法

1.精液常規(guī)分析 禁欲3～7 d后手淫或取精器取精液于干燥消毒量杯內(nèi)，置37℃水浴箱內(nèi)液化。按照世界衛(wèi)生組織(WHO)的精液分析標(biāo)準(zhǔn)[3]進(jìn)行分析。

2.精漿中性α-1，4-G活性及HYD活性檢測 精液以500×g離心10 min，分離上層精漿，置－20℃ 凍存?zhèn)溆?。采用酶法檢測精漿中性α-1，4-G活性，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。下層精子以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，采用改良固定底物膜法[4]進(jìn)行精子HYD陽性率及HYD活性強(qiáng)度檢測。

四、HYD活性檢測

1.HYD陽性反應(yīng)率 終止孵育后，每份孵育片于LeicaDME光學(xué)顯微鏡下均勻選取5～6個(gè)視野，隨機(jī)觀察200個(gè)精子頭部，出現(xiàn)周圍暈環(huán)者視為HYD陽性反應(yīng)。

2.HYD活性強(qiáng)度 采用測微尺測量視野下每個(gè)精子頭部暈環(huán)直徑的大小，取其平均值作為判斷HYD活性強(qiáng)度的指標(biāo)。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、不育組和正常生育組精漿中性α-1，4-G活性、RSA參數(shù)及HYD活性比較

不育各組中精子密度、精子活動率和HYD活性(HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度)均明顯低于正常生育組(P＜0.01)。酶活性異常組的畸形精子率明顯高于正常生育組(P＜0.01)。活性正常組精漿中性α-1，4-G活性、精子密度、精子活動率及HYD活性(HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度)均高于酶活性異常組。見表1、圖1、圖2。

表1 不育組和正常生育組精漿中性α-1，4-G活性、RSA參數(shù)、HYD活性比較()

表1 不育組和正常生育組精漿中性α-1，4-G活性、RSA參數(shù)、HYD活性比較()

注:與正常生育組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;與酶活性正常組比較，#P ＜0.01

組別 例數(shù) 精漿中性α-1，4-G活性(m U)精子密度(×10 9/L)精子活動率(%)H Y D陽性反應(yīng)率(%)H Y D活性強(qiáng)度(μ m)畸形精子率(%)正常生育組 12 60.67 ±10.12 96.33 ±15.03 73.11 ±7.43 77.96±9.29 48.94 ±10.56 41.42 ±6.75不育組 52酶活性正常組 39 42.17 ±12.08＊＊65.09 ±22.41＊＊ 55.38 ±16.72＊＊ 44.15 ±14.39＊＊ 32.30 ±16.06＊＊51.99 ±9.92*酶活性異常組 13 14.12 ±2.91＊＊#25.21 ±17.10＊＊#29.00 ±10.07＊＊#20.90 ±8.92＊＊#10.09 ±5.41＊＊#57.21 ±7.23＊＊

圖1 正常生育組的HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度

圖2 酶活性異常組的HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度

二、精漿中性 α-1，4-G活性與 RSA參數(shù)、HYD活性相關(guān)分析

精漿中性α-1，4-G活性與精子密度、精子活動率和HYD活性(HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度)呈正相關(guān)(r值分別為 0.816、0.890、0.872和0.847，P 均 ＜0.01);與畸形精子率呈顯著負(fù)相關(guān)(r= －0.579，P ＜0.01)。

表2 精漿中性α-1，4-G活性與精液參數(shù)、HYD活性的相關(guān)分析

討 論

附睪對于精子成熟與儲存具有重要作用。精漿中性α-1，4-G是由附睪上皮分泌。研究表明，中性α-1，4-G可通過催化精子糖原降解，為精子基本代謝、成熟、獲能、運(yùn)動和受精提供能源[1]。在某些異常情況下，如附睪炎、輸精管道阻塞時(shí)中性α-1，4-G分泌減少，精漿中酶活力降低，影響精子的能源供應(yīng)，影響生育[5];還有感染、不良生活習(xí)慣等[6-7]因素。精液中高濃度一氧化氮(NO)也可能是男性生育力下降的原因之一[8]。

Mahmoud等[9]報(bào)道不育癥患者精漿中性α-1，4-G活性與精子數(shù)目、精子活動力呈正相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示中性α-1，4-G活性與精子密度、精子活率呈正相關(guān)。由此推測這種相關(guān)性可能是睪丸生精過程與該酶活性水平都受到雄性激素調(diào)節(jié)所致。本研究結(jié)果還顯示，隨著中性α-1，4-G活性降低，精子密度減少、精子活動率減弱，而畸形精子率隨之增加。這與劉睿智[10]等報(bào)道的結(jié)果不相一致，推測原因正如一些研究[11-12]所報(bào)道:精漿中性α-1，4-G活性與精子正常形態(tài)率呈正相關(guān)，這可能與附睪功能正常者精子形態(tài)成熟度較高有關(guān);反之，精漿中性α-1，4-G活性偏低多提示附睪功能存在異常，可導(dǎo)致未成熟精子比例增高，并通過活性氧損傷和凋亡等機(jī)制影響精子形態(tài)和存活。說明任何可能引起附睪功能受損或精漿中性α-1，4-G活性減低的因素都會導(dǎo)致精液質(zhì)量下降。

研究表明，生殖道感染對附睪功能有干擾作用，導(dǎo)致中性α-1，4-G活性降低。同時(shí)引起附睪功能障礙因素(如附睪炎、解脲脲原體感染)亦可引起精子頂體膜破損，使頂體內(nèi)酶流失，導(dǎo)致部分患者不育[13]。精子HYD是一種存在于精子頂體的重要酶。HYD活性檢測是一種有效檢查精子受孕能力的手段[14]。本研究運(yùn)用改良固定底物膜法來檢測精子頂體內(nèi)HYD活性，能反映單個(gè)精子內(nèi)HYD活性的強(qiáng)弱及陽性率高低，比以往的生化檢測法更具臨床優(yōu)勢及實(shí)用性。本研究結(jié)果表明精漿中性α-1，4-G活性與HYD活性(HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度)呈正相關(guān)，且正常生育組HYD活性(HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度)明顯高于不育各組。說明精漿中性α-1，4-G活性可影響頂體內(nèi)酶活性，精漿中性α-1，4-G活性低下可能是導(dǎo)致男性不育的主要原因之一。

綜上所述，精漿中性α-1，4-G活性可以影響精子密度、活率、畸形精子率、HYD活性(HYD陽性反應(yīng)率、HYD活性強(qiáng)度)，從而影響生育。因此，精漿中性α-1，4-G活性為臨床診斷男性不育、評估精子生育能力提供了一個(gè)基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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