許沙沙，常彥敏，徐 霖，馮發(fā)深，何 霞，王 鑄，張定梅，曹開源

(1.衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院檢驗科，河北 衡水 053000;2.鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000;3.中山大學(xué)臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，廣東 廣州 510080)

流感病毒是有包膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬于正黏病毒科(orthomyxoviridae)，根據(jù)核衣殼蛋白和基質(zhì)蛋白不同，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)3型[1]。甲型H1N1流感于2009年3月在墨西哥爆發(fā)，最初被稱為“人感染豬流感”，世界衛(wèi)生組織將流感大流行警告級別提高為6級[2]，2009年4月中國衛(wèi)生部發(fā)布公告，明確將豬流感更名為“甲型H1N1流感”。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，截至2010年3月19日，這種新病毒已經(jīng)波及213個國家，共造成16813例死亡[3]。許多學(xué)者認(rèn)為華南地區(qū)是世界流感流行的一個主要起源地，因此加強(qiáng)對甲型H1N1流感的監(jiān)測對我國傳染病防控具有重要意義[4]。神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase，NA)是流感病毒表面重要的糖蛋白，是甲型流感病毒主要抗原之一，對于流感病毒從感染細(xì)胞中的釋放非常重要。為了監(jiān)測甲型H1N1流感NA基因的變異情況，及時發(fā)現(xiàn)具有流行病學(xué)意義的耐藥株，我們對2010年從廣州采集的1194份呼吸道標(biāo)本中分離到的6株甲型H1N1病毒株NA基因進(jìn)行測序，與2009年的代表株進(jìn)行比對，對其耐藥位點(diǎn)和同源性進(jìn)行分析，了解其變異情況，為今后流感的監(jiān)控和防治提供參考資料。

材料和方法

一、標(biāo)本來源

2010年2到12月廣州市中山大學(xué)附屬二院和三院發(fā)熱門診病例咽拭子標(biāo)本1194份，病例納入標(biāo)準(zhǔn)為:發(fā)熱3 d以內(nèi)，體溫≥38℃;伴有咳嗽或咽喉疼痛等急性上呼吸道感染癥狀。

二、毒株

2010年本實驗室分離的甲型H1N1流感病毒和2009年3月本實驗室從廣州市第1例甲型H1N1流感病毒感染患者體內(nèi)分離的毒株，名稱為A/Guangdong/03/2009(H1N1)(GenBank登錄號GQ250161);從GenBank中選取北京、上海、廣東三地在2009年甲型H1N1流感流行時的NA序列共9株，用以基因分型和比較，見表1。

表1 NA基因用以進(jìn)化分析的毒株

三、RNA的提取和cDNA的合成

對采集的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行處理，各取200 μL提取RNA(QIAmp MiniElute Virus Spin試劑盒)，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA(Invitrogen，SuperscriptⅢ first strand逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)，操作步驟參照說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為:25℃ 10 min，50℃ 50 min，85℃5 min，37 ℃ 20 min。

四、甲型流感檢測

對1194份標(biāo)本的cDNA全部進(jìn)行甲型流感病毒檢測。

1.引物 參照國家流感中心下發(fā)的引物，目標(biāo)片段為M基因，上游引物5'-TTCTAACCGAGGTCGAAACG-3'，下游引物 5'-ACAAAGCGTCTACGCTGCAG-3'，特異產(chǎn)物長度235 bp。

2.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)體系 TaKaRa ExTaq mix 12.5 μL，焦碳酸二乙酯水 7.5 μL，上、下游引物各 2 μL;cDNA模板 1 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min，94 ℃30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)，72 ℃10 min。

五、甲型H1N1流感病毒檢測

對甲型流感病毒檢測陽性的標(biāo)本進(jìn)行甲型H1N1流感病毒特異PCR檢測。

1.引物 參照國家流感中心下發(fā)的引物，目標(biāo)片段為HA基因，上游引物5'-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3'，下游引物5'-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3'，特異產(chǎn)物長度153 bp。

2.PCR 同上。

六、NA克隆和序列測定

參考GenBank中甲型H1N1流感病毒株NA序列(GenBank登陸號GQ250162)分別設(shè)計分段引物 NA-1和 NA-2，NA-1引物擴(kuò)增1～643 bp，NA-2引物擴(kuò)增 505～1410 bp，NA基因全長1410 bp，引物序列見表2。

表2 NA基因擴(kuò)增引物

PCR 反應(yīng)體系:TaKaRa ExTaq mix 25 μL，焦碳酸二乙酯水 15 μL，上下游引物各 4 μL，cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。

膠回收試劑盒(TAKATA)回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD 18-T Vector(TAKATA)，轉(zhuǎn)化 DH-5α感受態(tài)細(xì)胞，用Amp+LB篩選陽性菌落提取重組質(zhì)粒，PCR初步鑒定重組質(zhì)粒，送上海英駿公司測序。

七、變異分析

利用 Clustal 1.83軟件[5]對測序毒株 HA基因序列和氨基酸序列進(jìn)行比對和分析，利用Glyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-NGlyc/)在線軟件預(yù)測其糖基化位點(diǎn)，并對其耐藥位點(diǎn)進(jìn)行分析。

八、系統(tǒng)進(jìn)化分析

將分離的6株廣州甲型H1N1流感病毒分離株和從GenBank中篩選的9株甲型H1N1流感病毒的 HA基因用 MEGA4.0軟件[6]近鄰連接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

結(jié) 果

一、標(biāo)本流行病學(xué)資料

1194份咽試子標(biāo)本中檢測甲型流感病毒327份，其中檢測到H1N1流感病毒6株。

二、甲型流感病毒PCR檢測結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明成功擴(kuò)增大小約235 bp的甲型流感病毒特異性片段，見圖1。

三、H1N1流感病毒PCR檢測結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果表明成功擴(kuò)增大小約153 bp的甲型H1N1流感病毒特異性片段，見圖2。

四、甲型H1N1流感病毒的NA基因PCR擴(kuò)增及測序

6株甲型H1N1流感病毒分離株NA-1段基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物全長643 bp，見圖3。6株甲型H1N1流感病毒的NA-2段基因的逆轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物全長905 bp，與理論值相符，見圖4?；厥誔CR擴(kuò)增產(chǎn)物，與T載體連接，由上海英駿公司進(jìn)行測序(結(jié)果略)。

圖1 甲型流感病毒電泳結(jié)果(部分結(jié)果)

圖2 甲型H1N1流感病毒電泳結(jié)果

圖3 NA-1片段逆轉(zhuǎn)錄PCR電泳結(jié)果

五、變異分析

1.NA基因同源性分析 2009年流感病毒代表株和2010年流感病毒分離株共15株，將其NA基因共1410個堿基，用Clustalx 1.83進(jìn)行序列比對，用BioEdit軟件得到15株NA基因的氨基酸相似性矩陣，見表3。2010年分離株和2009年代表株氨基酸相似性較高，介于0.985～0.999。

圖4 NA-2片段逆轉(zhuǎn)錄PCR電泳結(jié)果

表3 NA核酸相似性矩陣

2.NA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 根據(jù)NA基因全長序列(1410 bp)，對2009年代表株和2010年分離株共15株甲型H1N1流感病毒株進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，包括本研究分離到的6株，還有選取的2009年代表株。在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，15株毒株分成了3個分支，見圖5。

3.氨基酸變異分析 2010年分離的6株甲型H1N1流感病毒的NA基因與2009年中國大陸的代表株比對，6株分離株共有30個堿基位點(diǎn)發(fā)生突變，其中有義突變?yōu)?6個，3個位點(diǎn)和NA活性相關(guān)，其中222位氨基酸的變異位于NA活性位點(diǎn)上，未發(fā)現(xiàn)H275Y耐藥位點(diǎn)的變異，見表4。

圖5 甲型H1N1流感病毒NA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

表4 2010年分離株和2009年代表株NA片段氨基酸比對結(jié)果

4.糖基化位點(diǎn)變異分析 分別將2010年廣州市分離到的6株甲型H1N1病毒株和2009年代表株NA基因進(jìn)行糖基化位點(diǎn)的預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4株甲型H1N1病毒株的糖基化位點(diǎn)和2009年代表株相比并沒有明顯的變化。

5.NA蛋白結(jié)構(gòu)建模 通過蛋白分析專家系統(tǒng)EXPASY(http://ca.expasy.org/)提供的蛋白組學(xué)和序列分析工具SWISS-MODEL，模擬構(gòu)建各NA蛋白的空間構(gòu)象。3株病毒株在NA活性位點(diǎn)222位、228位和425位等氨基酸位點(diǎn)處發(fā)生了變異，見圖6。

圖6 NA蛋白三維結(jié)構(gòu)

討 論

NA蛋白是流感病毒包膜上重要的糖蛋白，能切斷細(xì)胞表面的唾液酸，促使病毒從感染細(xì)胞膜上釋放，防止子代病毒自身凝集，促進(jìn)病毒擴(kuò)散并增強(qiáng)其感染能力。由于NA在流感病毒復(fù)制和傳播中起重要作用，且其活性中心的氨基酸組成高度保守，因此是研制抗流感藥物的重要靶點(diǎn)。

目前抗流感藥物有2種:一種為M2離子通道阻滯劑，如金剛烷胺，但是其副作用很大，而且很容易產(chǎn)生耐藥株，有學(xué)者報道現(xiàn)在流感病毒對烷胺類的耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重[7-8]。而2009年甲型H1N1流感病毒對烷胺類耐藥情況同樣嚴(yán)重，主要是在NA第31位氨基酸的變異(S31N)[9]。在這種情況下NA抑制劑成為目前抗流感病毒研究的熱點(diǎn)[10]，而且奧司他韋對甲型流感和乙型流感都有效，不易引起耐藥性且耐受性好。但是自從奧司他韋應(yīng)用于臨床以來，不斷有耐藥株出現(xiàn)，耐藥率逐年上升，耐藥率在成人為0.4% ～1%[11]，在兒童為4% ～8%，其中日本兒童的耐藥率高達(dá)18%。

流感病毒NA的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖見圖7[12-13]，NA催化位點(diǎn)以及周圍相關(guān)位點(diǎn)高度保守[14-15]。直接參與催化作用的活性區(qū)域有5個，分別為 S1～S5，S1由3個氨基酸殘基(R118、R292、R371)組成，S2由2個氨基酸殘基(E227、E119)組成，S3由2個氨基酸殘基(W178、I222)組成，S4 由3 個氨基酸殘基(I222、R224、A246)組成，S5由2個氨基酸殘基(A246、E276)組成。間接參與催化作用的位點(diǎn)有 R156、Y406、S179、D198、E228、N294、E425 等氨基酸位點(diǎn)。

圖7 流感病毒NA的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖

這些位點(diǎn)都直接或間接地參與NA的催化，所以此處氨基酸如果發(fā)生突變，就會對NA的活性產(chǎn)生影響，減低流感病毒對NA抑制劑的敏感性，甚至?xí)?dǎo)致對NA抑制劑的耐藥。通過對本研究分離到的6株甲型H1N1流感病毒的NA基因的測序，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)部分毒株出現(xiàn)N42S、N59D、Q313K等的氨基酸位點(diǎn)變異，這些均未涉及NA催化位點(diǎn)。但是在A/Guangdong/ZS03/2010(H1N1)毒株中出現(xiàn)E228G氨基酸突變，A/Guangdong/ZS04/2010(H1N1)毒株出現(xiàn)E425G氨基酸突變，這些位點(diǎn)都與NA的活性有關(guān)，但這些毒株其耐藥性是否有變化，有待進(jìn)一步研究。

同時在 A/Guangdong/ZS01/2010(H1N1)毒株中出現(xiàn)N222S氨基酸的突變(雖然與文獻(xiàn)報道I222位突變的堿基不一樣，但是222位氨基酸還是存在突變的)。許多研究表明222位氨基酸的改變會導(dǎo)致流感病毒對 NA抑制劑的耐藥[16]。因此需繼續(xù)對其耐藥性密切監(jiān)測。

從NA三維結(jié)構(gòu)圖中可以看到NA活性位點(diǎn)組成一個疏水性的口袋狀結(jié)構(gòu)，可以結(jié)合NA抑制劑奧司他韋等藥物，起到抗病毒的作用。如果疏水性口袋狀結(jié)構(gòu)的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異，會導(dǎo)致無法結(jié)合奧司他韋等藥物，則會產(chǎn)生流感病毒耐藥株。盡管結(jié)構(gòu)圖中只有少部分氨基酸的突變，但突變位點(diǎn)在NA活性位點(diǎn)上可能對其耐藥性產(chǎn)生影響，需后續(xù)試驗繼續(xù)研究。

許多研究表明，275位氨基酸的變異會對奧司他韋產(chǎn)生耐藥[17]，通過比較分析2010年分離到的甲型H1N1流感病毒，均未發(fā)現(xiàn)275位的變異，提示在2010年廣州散發(fā)的甲型H1N1流感病毒對NA抑制劑仍然敏感。2010年分離株NA糖基化位點(diǎn)與2009年代表株比較并沒有變化，與Saxena等[18]的報道相同。同時發(fā)現(xiàn)2010年分離株與 2009年代表株同源性較高(0.985～0.999)，提示NA基因仍是同一來源，未發(fā)生較大變異。對NA系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，2009年代表株為一支，而2010年分離株為一支，說明2010年與2009年相比，NA基因有部分堿基發(fā)生變異。

通過以上分析，NA蛋白275位氨基酸并未出現(xiàn)變異，提示還沒有出現(xiàn)對奧司他韋的耐藥株，但是在NA活性中心周圍已經(jīng)存在有變異的氨基酸，可能會對其耐藥性有影響。同時隨著奧司他韋在臨床上的廣泛應(yīng)用，甲型H1N1流感病毒耐藥株在世界上其他國家不斷有報道，更應(yīng)該繼續(xù)加強(qiáng)對甲型H1N1流感病毒的耐藥性監(jiān)測以及序列分析工作，在分子遺傳進(jìn)化分析的基礎(chǔ)上，及時發(fā)現(xiàn)有流行病學(xué)意義的耐藥株，為國家制定甲型H1N1流感防控策略提供參考。

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