鮑彩麗，范倩燕，吳 迪，湯園園，談秋雯，張雪蓮

(1.復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院，上海 200093;2.安圖醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200093)

腸球菌屬細(xì)菌作為一種條件致病菌已成為醫(yī)院感染，尤其是尿路感染的重要病原體之一。臨床上常見(jiàn)的腸球菌屬細(xì)菌為糞腸球菌和屎腸球菌。氨基糖苷類(lèi)與作用于細(xì)菌細(xì)胞壁抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用是治療腸球菌感染的主要手段。一旦腸球菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)高水平耐藥，則協(xié)同作用消失[1]。為了解糞腸球菌和屎腸球菌耐藥性特征的變化情況，以指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，及時(shí)控制醫(yī)院感染，我們對(duì)從尿路感染患者中段尿中分離出的23株糞腸球菌和18株屎腸球菌進(jìn)行細(xì)菌耐藥性檢測(cè)，并分析其相關(guān)的耐藥基因。

材料和方法

一、菌株來(lái)源及鑒定

收集2012年1至10月安圖醫(yī)院檢驗(yàn)科從尿路感染患者中段尿標(biāo)本中分離出的41株腸球菌，其中糞腸球菌23株(56.1%)、屎腸球菌18株(43.9%)。同一患者連續(xù)分離出相同菌株，取首次分離菌株。菌種鑒定采用API板條(法國(guó)生物梅里埃公司)進(jìn)行鑒定。

二、藥物敏感性試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，試驗(yàn)方法與判斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012 年版規(guī)定[2]。藥物敏感性紙片、羊血瓊脂平板、水解酪蛋白胨瓊脂均為科瑪嘉公司產(chǎn)品。

三、腸球菌屬相關(guān)耐藥基因檢測(cè)

1.引物設(shè)計(jì)與合成 7種耐藥基因包括氨基糖苷類(lèi)藥物耐藥基因 aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ、aph(3')-Ⅲ，紅霉素耐藥相關(guān)基因ermB，四環(huán)素類(lèi)藥物耐藥基因tetM，萬(wàn)古霉素耐藥基因vanA、vanB。在GenBank中查詢(xún)腸球菌屬的耐藥基因的基因序列，運(yùn)用Primer Primer 5.0序列分析軟件設(shè)計(jì)引物，選擇最佳的引物進(jìn)行后續(xù)研究。由Invitrogen公司合成。基因序列見(jiàn)表1。

表1 腸球菌耐藥基因引物序列

2.腸球菌屬DNA的提取 取純培養(yǎng)菌落懸于細(xì)菌培養(yǎng)液1～5 mL，11500×g離心1 min后取沉淀，使用北京天根生化科技有限公司的TIANGEN細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取腸球菌屬DNA，－20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增 按照北京天根生化科技有限公司的PCR反應(yīng)試劑盒2×Taq MasterMix說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，各種耐藥基因擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)35次;72℃延伸7 min。

4.擴(kuò)增產(chǎn)物分析 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA Green染色后在紫外光下觀察電泳結(jié)果，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)攝像保存。

5.陽(yáng)性基因測(cè)序 測(cè)序由Invitrogen公司完成。測(cè)序結(jié)果采用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心的Blast軟件分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行 χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、腸球菌屬的藥物敏感性試驗(yàn)

屎腸球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素的耐藥率為100.0%，糞腸球菌對(duì)青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、紅霉素的耐藥率＞50.0%，糞腸球菌和屎腸球菌的耐高濃度慶大霉素的檢出率分別為56.5%和55.6%。屎腸球菌對(duì)青霉素、氨芐西林的耐藥性較糞腸球菌高(P＜0.01);屎腸球菌對(duì)紅霉素、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星等抗菌藥物的耐藥性與糞腸球菌比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。未檢出耐萬(wàn)古霉素的腸球菌。41株腸球菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率見(jiàn)表2。

表2 腸球菌對(duì)11種抗菌藥物的耐藥率

二、耐藥基因檢測(cè)

1.腸球菌屬耐藥基因檢測(cè) 41株多耐藥腸球菌中，陽(yáng)性基因 aac(6')/aph(2')、aph(3')-Ⅲ均檢出41株，檢出率均為100.0%;ant(6)-Ⅰ基因檢出40株，檢出率為97.6%;ermB基因檢出29株，檢出率為70.7%;tetM基因檢出15株，檢出率分別為36.6%;vanA和vanB基因檢出0株，檢出率均為0.0%。部分耐藥腸球菌的PCR產(chǎn)物電泳凝膠成像圖見(jiàn)圖1。大多數(shù)菌株存在≥2種耐藥基因。分離出的23株糞腸球菌中，tetM、ermB、aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ、aph(3')-Ⅲ基因陽(yáng)性檢出率分別為 65.2%、82.6%、100.0%、100.0%和100.0%;分離出的18株屎腸球菌中，tetM、ermB、aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ 和aph(3')-Ⅲ基因陽(yáng)性檢出率分別為 55.5%、55.5%、100.0%、94.4%和 100.0%。

圖1 部分耐藥腸球菌的PCR產(chǎn)物電泳凝膠成像圖

2.腸球菌屬耐藥表型與基因型比較 41株進(jìn)行基因檢測(cè)的多藥耐藥腸球菌中，對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥表型與基因型符合株有24株，符合率為58.5%;紅霉素類(lèi)耐藥表型與ermB基因型符合株有30株，符合率為78.9%;四環(huán)素類(lèi)耐藥表型與tetM基因型符合株有34株，符合率為61.8%。

3.陽(yáng)性基因的測(cè)序 本研究的陽(yáng)性基因的測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)NCBI的Blast軟件分析，并與NCBI已登錄的相應(yīng)基因序列相比較，結(jié)果一致。

討 論

近年來(lái)腸球菌屬作為條件致病菌所致的感染率持續(xù)升高，尤其對(duì)于那些有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、機(jī)體免疫力低下的患者，容易侵入體內(nèi)或易位，導(dǎo)致局部或全身感染。腸球菌由于其細(xì)胞壁厚，對(duì)多種抗菌藥物呈現(xiàn)固有耐藥。美國(guó)醫(yī)院感染監(jiān)視系統(tǒng)已將其列為醫(yī)院感染的第二大病原菌[3]。本研究分析了安圖醫(yī)院尿路感染患者中段尿中分離出的腸球菌屬細(xì)菌的耐藥率及其相關(guān)的耐藥基因。結(jié)果顯示分離出的腸球菌屬以糞腸球菌多見(jiàn)，占56.1%;屎腸球菌占43.9%。體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，屎腸球菌對(duì)青霉素和氨芐西林的耐藥率均為100.0%，糞腸球菌對(duì)青霉素和氨芐西林的耐藥率分別為52.2%和21.7%，未檢出耐萬(wàn)古霉素的腸球菌屬，與其他報(bào)道[4]有一定的差異，可能是由于菌株來(lái)源地區(qū)不同所致。另外，本研究藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，糞腸球菌和屎腸球菌的耐藥情況嚴(yán)重，其中屎腸球菌的耐藥性比糞腸球菌要嚴(yán)重得多，與文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]一致。屎腸球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和紅霉素的耐藥率明顯高于糞腸球菌，提示臨床對(duì)于屎腸球菌感染的經(jīng)驗(yàn)治療應(yīng)避免使用上述藥物。未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥的菌株，提示萬(wàn)古霉素等糖肽類(lèi)抗菌藥物仍是臨床治療腸球菌感染的最有效藥物。但是隨著萬(wàn)古霉素的大量應(yīng)用，耐萬(wàn)古霉素腸球菌的感染逐漸增多，這就要求我們一方面要不斷完善實(shí)驗(yàn)室對(duì)耐萬(wàn)古霉素腸球菌的檢測(cè)，另一方面還應(yīng)加強(qiáng)臨床對(duì)抗菌藥物使用的管理，尤其嚴(yán)格萬(wàn)古霉素等糖肽類(lèi)抗菌藥物使用的適應(yīng)征，防止和減緩耐萬(wàn)古霉素腸球菌的產(chǎn)生[7]。

腸球菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制主要是產(chǎn)生質(zhì)粒介導(dǎo)的氨基糖苷類(lèi)修飾酶，以aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ和 aph(3')-Ⅲ等基因型為常見(jiàn)。本研究41株臨床分離株中aac(6')/aph(2')和aph(3')-Ⅲ基因在糞腸球菌和屎腸球菌陽(yáng)性率均達(dá)到100.0%，ant(6)-Ⅰ基因陽(yáng)性率為97.6%。研究糞腸球菌與屎腸球菌表型與基因型的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥表型與基因型符合率為58.5%，屎腸球菌與糞腸球菌存在表型為敏感而檢出耐藥基因的情況，可能與基因未表達(dá)或表達(dá)不完全有關(guān)。研究表明氨基糖苷類(lèi)修飾酶基因在臨床分離腸球菌中的存在狀況十分廣泛，耐藥情況嚴(yán)重。

紅霉素耐藥相關(guān)基因ermB的檢出率達(dá)70.7%，erm(ermA、ermB)基因表達(dá)紅霉素核糖體甲基化酶，使細(xì)菌核糖體紅霉素作用靶位點(diǎn)發(fā)生甲基化，從而耐紅霉素。細(xì)菌一旦獲得erm基因，將對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)－林可酰胺類(lèi)－鏈陽(yáng)菌素B耐藥[8]。紅霉素類(lèi)耐藥表型與ermB基因型符合率為78.9%。

四環(huán)素類(lèi)藥物耐藥機(jī)制有2類(lèi)，一類(lèi)為產(chǎn)核糖體保護(hù)蛋白;另一類(lèi)為產(chǎn)TET外排泵蛋白。腸球菌屬可以通過(guò)獲得tetM基因表達(dá)核糖體保護(hù)蛋白使其免受四環(huán)素類(lèi)抗菌藥物的作用[9]。本研究中四環(huán)素類(lèi)藥物耐藥基因tetM陽(yáng)性率為36.6%。四環(huán)素類(lèi)耐藥表型與tetM基因型符合率為61.8%。

臨床分離的糞腸球菌和屎腸球菌在泌尿系統(tǒng)的感染最為常見(jiàn)，屎腸球菌對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率高于糞腸球菌，且多藥耐藥和高耐現(xiàn)象相當(dāng)嚴(yán)重。腸球菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制主要由 aac(6')/aph(2')、ant(6)-Ⅰ、aph(3')-Ⅲ基因介導(dǎo)，產(chǎn)生ermB基因則是腸球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物耐藥的主要原因，腸球菌攜帶tetM基因并表達(dá)是對(duì)四環(huán)素耐藥的主要原因。在治療時(shí)，應(yīng)根據(jù)耐藥特點(diǎn)及菌種間的耐藥性差異來(lái)選擇相應(yīng)的治療方案。目前萬(wàn)古霉素和利奈唑胺仍然是治療腸球菌感染的最好藥物。加強(qiáng)細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)，對(duì)于科學(xué)制定抗菌感染治療方案以提高救治成功率，并為細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查提供分子生物學(xué)依據(jù)具有實(shí)際意義。

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