羅光成，黃云麗，閆惠平，馮 霞，林 芳，凡瞿明，張國(guó)元

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 南充 637000;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院感染與免疫研究中心，北京 100069)

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病的基礎(chǔ)上，短期內(nèi)出現(xiàn)以黃疸和凝血功能障礙為主要臨床表現(xiàn)的急性肝臟損傷。我國(guó)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染率較高，HBV感染是肝衰竭的首要原因。在肝衰竭發(fā)生過(guò)程中肝組織依次經(jīng)受了免疫損傷、缺血缺氧性損傷和內(nèi)毒素血癥的三重打擊，其中免疫損傷在肝衰竭發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞因子在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中起著重要的作用，與肝衰竭過(guò)程中的肝細(xì)胞壞死和疾病臨床預(yù)后密切相關(guān)，如腫壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和 γ 干擾素(interferon-gamma，IFN-γ)等[1-5]。盡管越來(lái)越多的證據(jù)表明，細(xì)胞因子在A(yíng)CLF的發(fā)生、發(fā)展中起了重要的作用，但其與疾病預(yù)后的關(guān)系仍未完全闡明。我們采用Luminex技術(shù)檢測(cè)HBV相關(guān)ACLF患者血清多項(xiàng)細(xì)胞因子，以觀(guān)察ACLF患者血清細(xì)胞因子的變化情況，并探討細(xì)胞因子在臨床轉(zhuǎn)歸中的作用。

材料和方法

一、研究對(duì)象

收集2011年1月至2012年2月期間北京佑安醫(yī)院收治的HBV相關(guān)ACLF患者24例(治愈者13例，即癥狀體征明顯好轉(zhuǎn)或消失，肝功能轉(zhuǎn)至正常的患者;死亡者11例，包括宣布臨床死亡和經(jīng)專(zhuān)家評(píng)估無(wú)治愈可能而放棄治療的患者)，ACLF診斷符合2006年《肝衰竭診療指南》;收集同期住院的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者30例，CHB診斷符合2010版《慢性乙型肝炎防治指南》。同時(shí)設(shè)健康對(duì)照15名。全部病例均排除其他嗜肝病毒重疊感染、人類(lèi)免疫缺陷病毒感染和嚴(yán)重細(xì)菌、真菌感染，排除自身免疫性、酒精性、藥物性、脂肪性等其他因素引起的肝損傷，既往或近期未使用免疫抑制劑治療。本研究得到了北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)的支持，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書(shū)。終末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)公式:r=3.8 lnTBil(mg/dL)+11.2ln(INR)+9.6lnCRE(mg/dL)+6.4(病因:膽汁性或酒精性0，其他1)[6]，公式中l(wèi)n為自然對(duì)數(shù)natural logarithm 的縮寫(xiě)。3組對(duì)象的基本信息見(jiàn)表1。3組間年齡性別基本一致，ACLF組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)明顯高于 CHB組和對(duì)照組(P ＜0.01)。

表1 各組研究對(duì)象的一般情況

二、Luminex檢測(cè)多項(xiàng)細(xì)胞因子

采集患者入院時(shí)的外周血樣本并及時(shí)分離血清，檢測(cè)其 IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IFN-γ 和 TNF-α 濃度。取出Bio-Plex多細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BIO-RAD公司)平衡至室溫，按試劑說(shuō)明書(shū)稀釋樣本、標(biāo)準(zhǔn)品、抗體包被微球、生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體和藻紅蛋白(phycoerythin，PE)標(biāo)記的鏈霉親和素。首先，加入已稀釋的微球50 μL于96孔板，洗滌2次并吸去微孔內(nèi)緩沖液;加入50 μL已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品、陰陽(yáng)性對(duì)照和已稀釋樣本，室溫震蕩溫育30 min;洗滌3次，再加入已稀釋的檢測(cè)抗體25 μL，室溫震蕩溫育30 min;洗滌3次，再加入50 μL已稀釋的PE標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫震蕩溫育10 min;洗滌3次，再加入125 μL分析緩沖液重懸微球。震蕩混勻30 s后上機(jī)檢測(cè)。檢測(cè)儀器為Bio-Plex 200LUMINEX儀(美國(guó)BIORAD公司)。

三、血常規(guī)、血生化、乙型肝炎標(biāo)志物和HBV DNA載量檢測(cè)

血常規(guī)檢測(cè)采用日本Sysmex KX-21全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑。血生化檢測(cè)采用富士700全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑。乙型肝炎標(biāo)志物5項(xiàng)檢測(cè)采用德國(guó)羅氏Cobas e601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑。HBV DNA檢測(cè)采用美國(guó)ABI-7300熒光聚合酶鏈反應(yīng)儀，HBV核酸定量檢測(cè)試劑盒由湖南圣湘生物科技公司提供。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)(范圍)表示，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組對(duì)象細(xì)胞因子水平的比較

ACLF組、CHB組和對(duì)照組3組間IL-6、IL-8和TNF-α水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，ACLF組＞CHB組 ＞對(duì)照組;HBV DNA、乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)等病毒學(xué)指標(biāo)在各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

二、細(xì)胞因子和MELD評(píng)分在不同臨床轉(zhuǎn)歸ACLF患者中的比較

死亡組IL-6、TNF-α水平和MELD評(píng)分明顯高于治愈組(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表2 ACLF組、CHB組和對(duì)照組細(xì)胞因子及HBV DNA、HBsAg水平的比較

表3 不同臨床轉(zhuǎn)歸ACLF患者細(xì)胞因子和MELD評(píng)分的比較

三、細(xì)胞因子與臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

由于 ACLF 組 IL-6、IL-8、TNF-α 明顯升高，且死亡組IL-6、TNF-α明顯高于治愈組，進(jìn)一步分析ACLF 患者 IL-6、IL-8、TNF-α 與 ALT、AST、凝血酶原活動(dòng)度(prothrobin activity，PTA)、MELD評(píng)分等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示IL-6、TNF-α與PTA 呈明顯負(fù)相關(guān) (r= －0.521，P=0.009;r=－0.712，P ＜ 0.001);TNF-α、IL-6 與 MELD 評(píng)分之間呈明顯正相關(guān)(r=0.491，P=0.015;r=0.379，P=0.048)。而其他細(xì)胞因子與 ALT、AST、HBV DNA、HBsAg等指標(biāo)之間無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)圖1。

圖1 IL-6、TNF-α與PTA、MELD評(píng)分之間相關(guān)性分析

討 論

在我國(guó)，HBV相關(guān)的ACLF是肝衰竭的主要類(lèi)型，其發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚未完全明確。有研究表明，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)是 ACLF的重要病理生理過(guò)程之一，而細(xì)胞因子在SIRS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[2]。ACLF的二次損傷學(xué)說(shuō)也同樣強(qiáng)調(diào)細(xì)胞因子的重要性。二次損傷學(xué)說(shuō)認(rèn)為:HBV感染后，機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，特異性CTL為清除HBV而攻擊感染HBV的肝細(xì)胞，從而造成大量的肝細(xì)胞溶解和凋亡，這稱(chēng)為原發(fā)性損傷。原發(fā)性肝損傷能引起腸源性?xún)?nèi)毒素血癥，并激活Kuffer細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，進(jìn)而啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在介導(dǎo)肝臟損傷的同時(shí)還進(jìn)一步募集大量非特異性炎性細(xì)胞于肝臟，從而對(duì)肝臟造成更為嚴(yán)重的二次損傷，甚至導(dǎo)致肝衰竭[6-7]。

細(xì)胞因子是細(xì)胞間信號(hào)傳遞分子，根據(jù)其功能可以分為促炎細(xì)胞因子 (如IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ)和抗炎細(xì)胞因子(如 IL-4、IL-10)[8-9]。本研究通過(guò)對(duì)ACLF組、CHB組和對(duì)照組細(xì)胞因子水平的比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn) IL-6、IL-8和 TNF-α水平從對(duì)照組到ACLF組呈逐漸升高趨勢(shì)(ACLF組＞CHB組＞對(duì)照組)，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);IL-4、IL-10等其他細(xì)胞因子在A(yíng)CLF患者無(wú)明顯升高。Mao等[10]和 Zou 等[11]的研究結(jié)果表明，ACLF患者肝內(nèi)IFN-γ和TNF-α表達(dá)較CHB患者明顯升高，而抗炎性細(xì)胞因子IL-10卻沒(méi)有相應(yīng)的升高，這種促炎和抗炎細(xì)胞因子表達(dá)失衡可能是ACLF發(fā)生的免疫病理機(jī)制。然而本研究結(jié)果中盡管升高細(xì)胞因子的種類(lèi)不盡相同，但也同樣發(fā)現(xiàn)了促炎和抗炎細(xì)胞因子表達(dá)失衡。這提示IL-6、IL-8和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子升高與ACLF的發(fā)生密切相關(guān)，可能在肝臟損傷等病理過(guò)程中起重要作用。

由于 IL-6、IL-8、TNF-α 等細(xì)胞因子可能在A(yíng)CLF病理生理過(guò)程中起重要作用，故本研究進(jìn)一步比較了死亡組和治愈組之間的IL-6、IL-8和TNF-α水平。結(jié)果顯示，死亡組IL-6和TNF-α水平顯著高于治愈組(P＜0.05)。這提示IL-6和TNF-α嚴(yán)重升高時(shí)預(yù)示著疾病預(yù)后不良。在本研究中的ACLF患者均伴有一種或多種并發(fā)癥，并且死亡組的并發(fā)癥數(shù)量更多、更嚴(yán)重。這表明促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α與ACLF的并發(fā)癥之間可能互為因果、相互促進(jìn)。有研究表明，血液循環(huán)中高濃度的細(xì)胞因子也會(huì)產(chǎn)生激素樣的內(nèi)分泌效應(yīng)，其作用于遠(yuǎn)離分泌部位的其他組織器官，從而導(dǎo)致血壓升高、肺損傷和腦水腫等并發(fā)癥的產(chǎn)生[10]，這可能在一定程度上解釋了高濃度細(xì)胞因子、并發(fā)癥和疾病預(yù)后不良三者間的關(guān)系。

IL-6和 TNF-α均是強(qiáng)效的促炎細(xì)胞因子。有研究表明，血清IL-6水平與肝細(xì)胞壞死程度相關(guān)，并且可在一定程度上反映急性肝衰竭的嚴(yán)重程度[4，12];TNF-α 是造成肝細(xì)胞損傷的主要因子，高水平的TNF-α可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡與壞死[6]。本研究對(duì)ACLF患者血清IL-6、IL-8、TNF-α水平與ALT、AST、PTA和MELD評(píng)分的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示TNF-α、IL-6與PTA呈明顯負(fù)相關(guān)，TNF-α、IL-6與MELD評(píng)分呈明顯正相關(guān)。MELD評(píng)分是用于判斷終末期肝病嚴(yán)重程度和生存率的預(yù)測(cè)指標(biāo)，PTA也是反應(yīng)肝臟合成功能和疾病嚴(yán)重程度的指標(biāo)。這說(shuō)明IL-6和TNF-α與疾病嚴(yán)重程度和臨床轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，可能是判斷疾病嚴(yán)重程度和臨床預(yù)后的新指標(biāo)。

綜上所述，HBV相關(guān)ACLF患者血清中多種細(xì)胞因子明顯升高，其中促炎細(xì)胞因子IL-6和TNF-α隨疾病嚴(yán)重程度的增加而增加(ACLF死亡組＞ACLF治愈組＞CHB組＞對(duì)照組)，且與PTA、MELD評(píng)分之間有良好的相關(guān)性。這提示細(xì)胞因子可能在A(yíng)CLF發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，并且促炎性細(xì)胞因子(如IL-6、TNF-α)與SIRS之間可能互為因果，共同促進(jìn)ACLF的發(fā)生。因此，檢測(cè)血清細(xì)胞因子變化對(duì)ACLF患者疾病嚴(yán)重程度和臨床轉(zhuǎn)歸的判斷有重要意義。然而，本研究?jī)H分析了血清細(xì)胞因子的表達(dá)變化，由于血清細(xì)胞因子來(lái)源復(fù)雜，故只能在一定程度上反映肝臟的細(xì)胞因子變化特點(diǎn)。另外，因研究對(duì)象特殊而使ACLF組樣本量較小，故尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行觀(guān)察和研究。

[1]Li K，Li NL，Wei D，et al.Activation of chemokine and inflammatory cytokine response in hepatitis C virus-infected hepatocytes depends on Toll-like recep-tor 3 sensing of hepatitis C virus double-stranded RNA intermediates[J].Hepatology，2012，55(3):666-675.

[2]葉一農(nóng)，高志良.乙型肝炎肝衰竭發(fā)生機(jī)制中的三重打擊[J].傳染病信息，2009，22(5):276-279.

[3]Graziadei IW.The clinical challenges of acute on chronic liver failure[J].Liver Int，2011，31(Suppl 3):24-26.

[4]Martin CM，Welge JA，Shire NJ，et al.Cytokine expression during chronic versus occult hepatitis B virus infection in HIV co-infected individuals[J].Cytokine，2009，47(3):194-198.

[5]李子安，阿祥仁，顧玉海.高原地區(qū)慢性肺心病患者 IL-6、IL-8、IL-17、IL-18 含量檢測(cè)及臨床意義[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，27(7):617-618.

[6]Kamath PS，Wiesner RH，Malinchoc M，et al.A model to predict survival in patients with end-stage liver disease[J].Hepatology，2001，33(2):464-470.

[7]González-Reimers E，Sánchez-Pérez MJ，Santolaria-Fernández F，et al.Changes in cytokine levels during admission and mortality in acute alcoholic hep-atitis[J].Alcohol，2012，46(5):433-440.

[8]梁 偉，楊 暉，吳春芳，等.不同調(diào)脂治療方案對(duì)冠心病患者血脂和 IL-6、TNF-α水平的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(3):193-197.

[9]Stanley AC，Lacy P.Pathways for cytokine secretion[J].Physiology(Bethesda)，2010，25(4):218-229.

[10]Mao WL，Chen Y，Chen YM，et al.Changes of serum cytokine levels in patients with acute on chronic liver failure treated by plasma exchange[J].J Clin Gastroenterol，2011，45(6):551-555.

[11]Zou Z，Li B，Xu D，et al.Imbalanced intrahepatic cytokine expression of interferon-gamma，tumor necrosis factor-alpha，and interleukin-10 in patients with acute-on-chronic liver failure associated with hepatitis B virus infection[J].J Clin Gastroenterol，2009，43(2):182-190.

[12]李清明，舒仁明，王家駟，等.血清白介素-6在診斷肝細(xì)胞肝癌中的臨床價(jià)值研究[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，26(3):251-253.